基因表达的测定蛋白印迹法征求意见稿编制说明.doc

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1、基因表达的测定蛋白印迹法征求意见稿编制说明　　《基因表达的测定蛋白印迹法》国家标准编制说明（征求意见稿）　　一、任务本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会计划项目，项目编号为20180920-T-424。　　本项目由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。　　本标准起草工作由河北医科大学等单位共同完成。　　二、标准制定目的及意义蛋白印迹法（Westernblot）是检测混合样品中单一特定蛋白的常用实验技术，蛋白质进行变性凝胶电泳后，将其直接转印到固相膜支持物进行免疫反应，是进行蛋白检测和鉴定的一

2、种常规实验工具，采用免疫或生物化学方法对结合在膜上的蛋白进行分析、定量染色，同时可以准确阐述蛋白质-蛋白质之间的相互作用以及蛋白质与耦联体之间的相互作用。　　该技术集合凝胶上电泳分离的高分辨率和免疫检测特异性于一体，可以在复杂样品中鉴定和检测靶蛋白。　　蛋白印迹法在生命科学的各个领域有着广泛的使用，适用于各种各样的混合蛋白检测天然样品中提取的蛋白混合物、动植物组织、微生物、血液、体液、培养的组织和细胞、基因工程下游产品。　　用于各种蛋白的检测有着特异灵敏、检测简单、结果可靠等等很多优势。　　三、标准制定原则和

3、依据严格按照GB1.1-xx《标准化工作导则第1部分标准的结构和编写规则》的要求，制定该项国家标准。　　四、主要工作过程主要起草单位河北医科大学开展的主要工作过程如下　　1、xx年1月，组成标准起草工作组，安排了工作进度。　　2、xx年1月~xx年3月，起草工作组查阅了国内外有关标准中关于此方法的规定，调研了国内外有关基因表达的测定方法的情况，起草了标准讨论稿。　　3、xx年4月，标准起草工作小组对标准讨论稿进行了讨论，形成第二轮标准讨论稿。　　4、xx年5月，征求专家意见，形成第三轮标准讨论稿。　　5、xx

4、年3月~xx年11月，对目前多种基因表达的测定方法进行验证。　　6、xx年12月，召开标准研制推进会，对标准研制过程中的问题进行讨论，商讨解决方案。　　7、2018年1月，标准起草工作组邀请专家对标准讨论稿提出意见。　　8、2018年2月~2018年5月，进一步对标准讨论稿进行修订，形成标准草案。　　9、2018年7月，本标准经国家标准化管理委员会批准，获得立项。　　10、2018年10月，完成标准征求意见稿和编制说明的初稿。　　11、2018年11月，完成第三方论证，召开专家征求意见会，进行充分讨论，进一步

5、根据专家意见修改和完善征求意见稿。　　13、2018年12月~2019年2月，向全社会征求意见，并向中国科学院、中国农科院、清华大学、北京大学、复旦大学、中国医科大学、首都医科大学、河北省食品监督检验研究院、河北师范大学、河北医科大学第四医院、河北省人民医院、伯乐生物科学（中国）有限公司等高校、科研院所、企业、政府单位发函征求意见。　　截至到2019年3月1日，共收到7封意见书，提出征求意见46条。　　编写组对意见进行认真研究，采纳43条，未采纳3条，并对文中相应部分进行了修改与完善，形成了标准送审稿。　　1

6、4、2019年5月，中国标准化研究院组织专家进行审查。　　五、主要技术内容在本标准制定过程中，随着研究的深入，先后完成标准讨论稿、草案和标准征求意见稿，标准内容不断完善，并趋于科学合理。　　根据需要，本标准的主要技术内容确定为（一）前言部分。　　给出了标准的起草原则、归口单位、起草单位及主要起草人。　　（二）范围。　　给出了本标准的适用范围。　　（三）缩略语。　　给出了本标准中用到的缩略语。　　（四）术语和定义。　　给出了本标准中用到的相关术语及其定义。　　（五）试剂和材料。　　给出了本标准中用到的化学试剂、

7、缓冲液、试剂盒等。　　（六）仪器设备。　　给出了本标准所需的仪器和设备。　　（七）主要技术内容的说明　　1、蛋白样品的选择与准备阳性样品真核细胞重组SM22蛋白阴性样品SM22基因敲除小鼠原代血管平滑肌细胞测试样品动物组织/细胞、植物组织/细胞　　2、Westernblot分析特异性的检测本实验选取真核细胞重组SM22蛋白作为阳性样品，SM22基因敲除小鼠原代血管平滑肌细胞作为阴性样品，进行Westernblot分析，测定SM22的水平。　　如Fig.1所示，左侧阳性样品有特异性条带，而右侧阴性样品未见任何条

8、带。　　提示，Westernblot方法有着较强的特异性。　　Fig.1Westernblot特异性分析　　3、蛋白酶抑制剂对总蛋白提取的影响本实验选取常见的蛋白酶抑制剂，按其说明书浓度使用，以不加蛋白酶抑制剂为对照，在相同条件下裂解小鼠胸腹主动脉血管组织，结果见Fig.1。　　加入适量的蛋白酶抑制剂，样品放置于室温1d，蛋白电泳后条带依然比较完整（Fig.1A）；未加入蛋白酶抑制剂，样品放置于室温