脑神经系统-神经解剖学研究方法.ppt

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1、神经解剖学的研究方法一、传统的研究方法（一）大体研究方法：显示脑血管、主要核团和纤维束、脑室等。塑化标本用于断面解剖学。（二）组织学研究方法：固定、切片、染色1.H.E染色2.硝酸盐镀染：机制不清(显示神经元轮廓和突起的行向)。3.Nissl法：碱性染料---核酸结合(焦油紫、甲苯胺蓝、培花青等)。二、近代的研究方法（一）组织化学的研究方法：生化学+组织学：固定良好，称量准确，器皿洁净，严格操作。1.酶组化：底物(有色)原位沉淀四氮唑盐或金属(铅、钴、铜)(1)胆碱能神经元的检测：乙酰硫胆碱硫胆碱铁氰化物亚铁氰化

2、物(2)NO能神经元的检测：β还原辅酶A蓝色沉淀硝基四氮唑蓝酶AchECu棕色沉淀++(黄递酶)NOS（二）荧光组化(FluorescenceHistochemistry)自发荧光和诱发荧光：紫外光标本激发滤片物镜吸收滤片目镜1.单胺荧光组化：(1)甲醛诱发荧光：(2)乙醛酸诱发荧光：CA四氢异喹啉双氢异喹啉5HT四氢β-咔啉二氢β-咔啉FAorGA蛋白催化H+(绿色荧光)FAorGA蛋白催化H+(黄色荧光)(三)免疫组化(Immunohistochemistry)1.原理：抗原抗体反应。重链N端可变区抗体活性部

3、分Fab段轻链C端稳定区抗原决定簇Fc段C端FcFabN端重链轻链C区V区C区抗原第一抗体F标记物直接法抗原第一抗体间接法第二抗体F标记物2.PAP法的原理注意事项：1)一抗的特异性要强，效价要高。2)二抗的量要足(双桥PAP法)。3)PAP复合体与一抗来自同一动物种属。4)要设对照试验(吸收试验、置换试验、交叉试验)。5)提高染色质量的措施：H2O2甲醇液—去内源性HRP；TritonX-100—增加通透性；酶消化，微波—重新释放抗原。(四)免疫荧光组化基本原理：显示标记物改酶标为荧光素(异硫氰酸荧光素FITC

4、、四甲基异硫氰酸罗达明TRITC)，在荧光显微镜下观察。AB直接(A)和间接(B)免疫荧光法原理示意图(五)亲合免疫组织化学1.原理：是利用两种物质之间的高度亲和力与免疫反应结合起来的技术。这些物质包括：植物凝集素与糖类，生物素与亲合素，葡萄球菌A蛋白与IgG，阳离子与阴离子，激素与受体。2.ABC法的原理(AvidinBiotin-peroeidaseComplex)亲合素—生物素过氧化物酶复合体3.ABC法的优点：(1)灵敏度高；(2)非特异性着色较少；(3)使用和操作较简便。4.SABC法的原理(Strep

5、tAvidinBiotin-enzymeComplex):链酶亲合素—生物素—酶复合物亲合素链酶亲合素分子中含寡糖不含糖链等电点高(10~10.5)等电点不高(6~6.5)非特异性染色++(与人源性凝集素样蛋白质结合；与细胞膜、核起反应)—(六)原位杂交组化技术(in-Situhybridizationhistochemistry,ISHH)1.原理：是用碱基序列已明了的，并被同位素标记的核酸探针与组织或细胞中待测的核酸杂交，对待测核酸进行定性、定位和相对定量的技术。多用于蛋白质合成的动态变化、递质共存、亚核和追

6、踪定性等方面的研究。cDNAmRNA(转录)多肽链蛋白质RNA聚合酶反转录酶tRNA核糖体GCTA(DNA)CGATGCUA(RNA)CGAU2.注意事项：戴手套；器械高压消毒；固定的要求更严格；标本制备过程中尽量避免RNA酶的污染。三、束路追踪技术(一)HRP(HorseradishPeroxidase)辣根过氧化物酶1.原理：神经元轴浆运输：顺行、逆行。2.种类：(1)游离HRP：(2)结合HRP：麦芽凝集素—HRP(WheatGermagglutinin—HRP)霍乱毒素—HRP(Choleratoxin—

7、HRP)为酶标配体。优点：灵敏度高，用量小，显示充分，降解时程长。(3)主要步骤：①HRP的引入②存活。最佳存活期(日)＝(束路长度毫米/350毫米)+1日③固定取材。④切片。⑤组织化学反应：DAB法成色剂+H2O2(二氨基联苯胺)TMB法(四甲基联苯胺)HRP+H2O2HRP·H2O2络合物HRP·H2O2+(CHR)H2CHR+2H2O2吲哚胺聚合体吩嗪多聚体压力注射法电泳法(HRP溶液接正电极，实验动物接负电极)(二)荧光素逆行标记(Fluorescentretrogradelabellingmethod)

8、1.原理：2.特点：(1)种类多，荧光颜色各异。(2)标记神经细胞的部位各异。(3)可单、双、多标记，用以研究轴突分支投射。(4)切片易褪色，荧光显微镜的滤片要齐全。(三)放射自显影神经追踪(AutoradiographicNerveTracingmethod)1.原理：将3H、14C标记的氨基酸注入神经组织，被神经元胞体吸收后参与神经细胞的蛋白质合成，然后合成的物质随轴