《不同剂量原儿茶酸对脂多糖致急性肺损伤小鼠的作用及其机制研究-论文》.pdf

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1、242qActaAcadMedWeifangVo1．36No．42014I>急性肺损伤(acutelunginjury，AU)及急性呼吸窘PCA5rag／kg，地塞米松1mg／kg各0．1ml。1h后除对迫综合征(ARDS)是重症监护病房常见的危重症，随照组外，其它各组小鼠腹腔注射LPS5mg／kg，对照组着治疗技术的进展及规范化的保护性通气策略的推腹腔注射等体积生理盐水，造模6h后处死小鼠。广，ALI的病死率较前有所下降，但仍在较高水平，1．2．2标本的制备和处理造模后6h处死小鼠，留严重威胁患者生命。目前临床上治疗AⅡ的药物主要取小鼠肺脏标本、血清及肺泡灌洗液，详细操作

2、步骤如有糖皮质激素、吸入用一氧化氮、前列腺素E1、N-乙酰下所述：①血清的制备：用10％水合氯醛麻醉小鼠，固半胱氨酸和丙半胱氨酸等，但治疗效果尚不能令人满定好小鼠，立即行眼球取血，标本于离心管中静置意，且存在毒副作用J。近年来中医药在防治ALI方30min，4oC3000r／min离心10min，吸取血清于-80℃冻面取得了一定进展，有可能为ALI药物治疗提供新的存备用。②支气管肺泡灌洗液(BALF)的制备：取血方向。已证实PCA对脂多糖(1ip0p01ysaccharide，LPS)后立刻打开胸腔，暴露肺组织，分离肺组织，结扎右主诱导的ALI有保护作用J。Toll样受体4

3、(TLR4)是模支气管，经气管行左肺肺泡灌洗，用0．5ml高压灭菌的式识别受体，可选择性识别保守的微生物成分(如病PBS缓冲液缓慢冲洗肺组织3次，回收BALF，回收率毒双链RNA、脂多糖)来启动天然免疫并调节获得性约80％，置于离心管中，4℃3000r／min离心10min，取免疫，当环境因素、病原及前炎症细胞因子刺激下巨噬上清液置于一80℃冻存备用。③肺组织的制备：取下细胞可迅速上调TLR的表达含量_4J。TLR4在炎症右肺组织并固定右肺上叶。余右肺组织迅速置于液氮中发挥重要作用，是介导LPS特异性识别和信号转导中冻存。的重要受体，是LPS上游主要的调节器。本课题旨在1．

4、2．3肺组织病理学观察取下右肺组织分离右肺进一步探讨不同浓度原儿茶酸(protocatechuicacid，上叶并置于4％多聚甲醛固定，常规制备石蜡切片，苏PCA)预处理对ALl小鼠的干预作用及相关细胞因子木精．伊红(HE)染色，光镜下观察病理学变化。的改变，进一步了解PCA对ALI小鼠的作用机制，为1．2．4肺组织干质量(W／D)比值测定取左侧临床治疗ALI提供实验和理论依据。肺叶称湿质量(w)，80℃烤箱中烘烤48h后称干质量1材料与方法(D)，计算肺组织W／D比值。1．1实验材料1．2．5酶联免疫复合物法检测各组小鼠肺泡灌洗液1．1．1实验动物清洁级昆明小鼠60只，雌

5、雄各半，及血液中TNF一仅，IL一1B的表达严格按照ELISA试体重(20±2)g，购于山东绿叶制药有限公司，饲养于剂盒说明，检测BALF及血液中TNF-仪，IL一1B的表达，滨州医学院实验动物中心，动物合格证号：鲁动质字终止反应后用酶标仪测450nm处光密度值，并将其与200106003。小鼠分笼喂养于(24-4-1)oC、相对湿度为标准曲线比较以确定其浓度。40％～80％的室内，自由进食进水，12h光照，适应2—1．2．6WesternBlot检测肺组织中蛋白的表达称取3d后进行实验。将小鼠随机分成正常对照组、LPS模不同组肺组织，加人细胞裂解液后在冰上匀浆30min型

6、组、PCA高剂量组、PCA中剂量组、PCA低剂量组、后，4℃14O00r／min离心10min，分装上清储存于一地塞米松阳性对照组，每组1O只。80cC冰箱中，并依照BCA试剂盒要求进行蛋白浓度测1．1．2主要药物及试剂PCA购于南京替斯艾么中定。每组取501xl样品加上样缓冲液后95℃煮5min使药研究所；肿瘤坏死因子仅(TNF．o【)、白介素1B(IL．蛋白变性，而后进行10％SDS．PAGE，分离蛋白，并将1B)ELISA检测试剂盒购于上海朗顿生物科技有限公其转移到PVDF膜上，经TBST洗膜后，用5％脱脂奶司；兔抗鼠多克隆抗体TLR4，仅一tublin由巴傲得生物科

7、粉封闭2h，加入TLR4，OL．tublin多克隆抗体4~C过夜。技有限公司提供；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗TBST洗膜3次，每次5min，加辣根过氧化物酶标记的体购于北京康为世纪生物科技有限公司。1．2实验方法二抗，室温下于脱色摇床上反应1h，经TBST洗膜后加1．2．1动物分组及模型建立按随机数字表法将小入ECL发光液反应，x光片显影、定影。胶片扫描后鼠分成正常对照组、LPS模型组(LPS组)、PCA高剂量用相应软件分析光密度值，对结果进行分析。组(HPCA组)、PCA中剂量组(MPCA组)、PCA低剂1．