4单倍体细胞培养.ppt

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1、4单倍体细胞培养单倍体细胞培养包括三个方面：花药培养、小孢子培养、未受精子房及卵细胞培养。根据物种倍性不同，单倍体可以分为两大类：一类是一倍单倍体,即二倍体物种产生的单倍体；另一类是多倍单倍体,即起源于多倍体物种（如4x、6x）。花药培养是指未成熟的花药接种在人工培养基上分化为植株的过程。由于这种分化植株起源于花药中的未成熟的花粉，所以，人们常将花药培养和花粉培养相提并论。花药和花粉分属于不同的范畴，即花药是一个植株体上的器官，属于器官培养；而花粉则在一般意义上，是一个单细胞，应该属于细胞培养的范畴。植物界,在棉、水稻、咖啡、甜菜、大麦、大麻、可可、油菜、西红柿、芦笋和小麦等作物中,

2、都发现过自发产生的单倍体。某些低等的生物,如酵母、霉菌和苔藓等,以单倍体为主要的生活世代。被子植物的花药中，细胞按染色体的倍性可分为两类：一类为单倍体细胞，即由花粉中的花粉母细胞减数分裂后形成的小孢子；另一类为二倍体细胞，如药隔、药壁及花丝等组织。4.1花药培养花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养。我国花药培养工作虽然开始较晚，但在短短的时间内取得了可喜的进展，1974年中国农科院植物研究所和中国农业科学院烟草研究所，仅仅用了三年的时间，就培养出世界上第一个作物新品种---单育1号烟草品种。花药离体培养的方法是通过花粉粒直接培养出单倍体植株。花药离体培养法具有技术简单、诱导容易和诱

3、导频率高等优点,许多栽培物种都用这种方法获得了单倍体。子房培养是20世纪70年代发展起来的一门新技术,已经在小麦、玉米、水稻、青稞、大卫百合、烟草等植物中获得了成功。单倍体植株不存在显隐性的问题，一旦发生突变，即可以表达。理想的诱变方法是利用化学药物或者辐射处理。对于单倍体细胞的培养物（包括愈伤组织、原生质体、小孢子等），将其进行诱变，可以使植物育种微生物化，在过去的10多年的研究中，已经取得了令人满意的结果。花药培养的意义1.同常规的育种方法相比，利用花药培养可以大大缩短育种年限。2.利用花药培养的单倍体育种较常规育种便于根据表现型进行选择。3.单倍体加倍的纯度，较常规的自交选

4、育出来的自交系纯度要高的多。4.对于自交不亲和的物种可以获得杂交种子。5.在远源杂交方面具有较大的利用价值。花药培养的基本程序包括：①挑选适宜的基因型作材料；②确定花粉发育时期；③材料的预处理；④诱导培养；⑤分化培养；⑥染色体数观察和染色体数加倍；⑦花粉植株当代及后代观察鉴定。影响花药培养的因素很多，如材料生理状况和基因型、接种时期、接种方式(如直插、或平放)、培养方式(固体、漂浮、液体浅层连续培养、条件培养等)、基本培养基种类、激素、密度效应与条件培养等。4.2花粉培养花粉培养：把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤

5、组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。且不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是比花粉培养难度大。4.2.1材料的准备（1）材料消毒基本方法：取新鲜未开的花蕾用自来水冲洗10分钟，用75%的酒精消毒10-15分钟，无菌水冲洗2次，再用10%漂白粉上清液浸泡20分钟，无菌水冲洗3-4次。然后将花药放到加有基本培养基的小烧杯中，用注射器的内管在烧杯的壁上挤压花药，使花粉从花药中释放出来。用尼龙筛过滤掉药壁组织，滤液再经低速离心（100-160r/min)，上面的碎片可用吸管吸掉，再加入新鲜培养基。连续进行两次过滤，到每毫升含103-104个花粉的浓度即可。（2）选用适宜发育时

6、期的花粉花药培养成功的关键因素之一是花粉发育时期要合适。一般以单核晚期为宜。有的植物所需时期可能略早或略晚些。首先要确定合适花蕾的标准。在烟草中一般以花冠与萼片等长为准。也可通过观察花粉进一步确定。为此，取大小不同的幼嫩花蕾，从中取出花药，置于载玻片上，加一滴醋酸洋红染液，挤压出花粉，染色后在显微镜下观察，以花粉的单核靠边为准选取花蕾。（3）逆境处理对小孢子脱分化和再分化的影响①温度处理效应②高糖预处理效应由花粉发育成的单倍体植株只有配子一组染色体，是不能结实的。因而需要将染色体加倍成二倍体。组织培养中，可能自然加倍，但其频率低。常用的染色体加倍的办法是用秋水仙碱溶液浸泡小苗。当小苗

7、移入Nitsch培养基前，于无菌条件下，将0.2～0.4％的秋水仙碱溶液倒入培养瓶中，一般处理24～48小时。倒去秋水仙碱液，用无菌水洗3次后，再将小苗移至Nitsch培养基中继续培养，可能得到一些染色体加倍的再生苗。对于了解再生植株染色体是否加倍成功，可从形态上加以鉴别；单倍体植株株型矮小，叶片、气孔、花粉粒都小些，不能结实。但最可靠的办法还是制作染色体玻片标本，检查染色体数目。4.2.2诱导小孢子脱分化和再分化的措施1）掌握小孢子脱分化和再分化所需的时