第五章固定化酶及固定化技术.ppt

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1、第五章固定化酶及固定化技术酶：在水溶液中－不稳定一次性使用-难回收，难连续化生产用于医药/化学分析－纯度要求高产物的分离纯化困难。。。。－－－要求将酶变成不溶性－－－实际上将酶限制在一定空间固定化固定酶具有催化活性1916年，美国科学家发现，酶和载体结合以后，在水中呈不溶解状态时，仍然具有生物催化活性。固定化酶可重复使用——操作稳定性酶在固定化后其活力可以缓慢释放,酶的稳定性比天然状态高,可重复多次使用.结果如图所示:固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15%,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性例:将0.5gDEAE纤

2、维素固定化壳聚糖酶与10mL1%壳聚糖溶液在60℃下连续反应10次每次反应时间为6h每次反应后分别测定酶活力一、固定化酶（immobilizedenzyme）水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶性酶（固定化酶）什么是固定化酶？固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋等多种方法。与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和pH等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作

3、。酶生物反应器简史1916年，Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer&Schleith第一次实现了酶的固定化1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AA的光学分析上1971年，固定化酶名称提出，Immobilizedenzyme1973年，固定化微生物的应用——固定化大肠杆菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸1976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精1978年，日本用

4、固定化细胞生产酶——固定化枯草杆菌生产淀粉酶1979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究1982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸1986年，郭勇等人固定化原生质研究二、固定化酶的优缺点：稳定性高；酶可反复使用；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；固定化酶的反应条件易于控制生产可连续化和自动化，节约劳动力；设备小型化、可节约能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：缺点：固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化时，酶活力有损失长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大

5、分子底物不适宜与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应三、固定化酶制备必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化）避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。基本原则：固定化应该有利于生产自动化、连续化。载体能抗一定的机械力。固定化酶应有最小的空间位阻。酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。固定化酶应有最大的稳定性，

6、所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低，以利于工业使用。酶的固定化方法四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）——指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象较少或者不变化；载体廉价易得缺点：结合力弱，易解吸附选择载体的原则（1）要有巨大的比表面积（2）要有活泼的表面（3）便于装柱进行连续反应。1.物理吸附法SMS:一种硅酸盐载体有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶无机载体：氧化铅、皂

7、土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅藻土、二氧化钛等2.结合法离子键结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法。阴离子交换剂：DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，AmberliteIRA-93，410，900；阳离子交换剂：CM-纤维素，AmberliteCG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。使用注意：pH、离子强度、温度离子结合法的操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种

8、类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。归纳起来有二类：将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。(与交联法合用）共价结合法