实验7——茚三酮法测定氨基酸总量.ppt

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1、实验七：茚三酮法测定氨基酸总量1．实验原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：2.实验材料、仪器与试剂材料：酱油仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。试剂配制：讲义P32（1）2%茚三酮溶液（2）pH8.04的磷酸缓冲液（3）氨基酸

2、标准溶液：200μg/mL异亮氨酸标准溶液。3.实验步骤（1）样品的处理：量取0.5mL酱油于50mL烧杯中，加入5g活性炭和40mL的蒸馏水，在电炉上加热至80℃左右，保持半小时后过滤至100mL容量瓶中，用蒸馏水将滤渣清洗数遍后转移容量瓶中，定容至刻度线备用。（2）标准曲线的绘制及样品测定1234567、8、9水1.61.31.21.11.00.91.0氨基酸标准溶液00.30.40.50.60.70.6样品茚三酮0.40.40.40.40.40.40.4磷酸盐缓冲液0.40.40.40.40.40.40.4各种试剂

3、加到比色管后混匀，于水浴锅上沸水浴15min，取出冷却至室温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光值，以氨基酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。单位：mL4.结果计算氨基酸（μg/mL）=C×KV×100式中：C——从标准曲线上查得的氨基酸含量，μgK——稀释倍数V——测定时取样量，mL5.注意事项（1）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。（2）有颜色的样品必需经脱色处理至无色后方可使用。