茚三酮法测氨基酸.doc

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1、茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：　凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。二．仪器：721型分光光度计　台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪　烧杯试管架　　　　　　　　　　　试管水浴锅。三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液（2）pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：量取86mL2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL2mo

2、l/L乙酸混合而成。用pH检查校正。（3）茚三酮显色液：称取170mg茚三酮和30mg还原茚三酮，用20mL乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。（5）样品液：每毫升含0.5～50μg氨基酸。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于15～25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮，用12.5mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将0.5g维生素C用25mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三

3、酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mLpH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热1

4、5min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。1234560.3mmol/L标准氨基酸溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.202mol/L醋酸缓冲液111111茚三酮显色液111111OD570混匀，盖住试管口后在100°水浴加热15min，然后用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%的乙醇稀释，充分摇匀。2．氨基酸样品的测定取样品液1mL，加入pH5.4，2mo

5、l/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。