同工酶实验 宁波大学.ppt

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1、垂直电泳分离同工酶（活性染色鉴定法）实验目的：理解同工酶的概念及遗传学意义学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同.由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，在电泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定乳酸脱氢酶用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四

2、聚体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同同工酶的免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。实验器材：夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-1

3、00mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL），培养皿,实验流程试剂的配制仪器的准备动物组织的样品的获取分离胶（30分钟）浓缩胶（30分钟）电泳（2-3小时）染色（30分钟）观察结果一、试剂：1.凝胶储备液：Ａ储备液：pH8.9Tris~HCl缓冲液：1MHCl48ml，36.6gTris，加双蒸水到80ml，调节pH到8.9定容到100ml。Ｂ储备液：pH6.7Tris~HCl缓冲液：1MHCl48ml，5.98gTris，加双蒸水到80ml，调节pH到6.7定容到100ml。Ｃ储备液：分离胶储备液（30%Acr/Bis）：30gAcr，0.8gBis，用双蒸水

4、定容到100ml，备用，4℃存放可以保存1个月。Ｄ储备液：浓缩胶储备液：10gAcr，2.5gBis，用双蒸水定容到100ml，备用，4℃可以保存1个月。Ｅ储备液：10%Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。Ｆ储备液：40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。TEMED2.电泳缓冲液：Tris6.0g，28.8gGly加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用时稀释10倍。样品制备取材：　大黄鱼若干条，解剖取1.肠、2.眼睛、3.鳃、4.肌肉、5.脾、6.鳍、7.肝、8.心脏　放入冰箱保存。提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tr

5、is-Hcl(pH=7.0)此溶液需４℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为１：5,用研钵研磨充分。浆液４℃离心约３０分钟，１５０００转／分钟。取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加１００ul甘油和１０ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。分离胶的制备将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备用。取一100ml烧杯，按表比例混匀之后使用。储备液A储备液C储备液E储备液双蒸水TEMED总体积用量（ml）2.53.750.113.7510ul20配方表浓缩胶的制备TEMED最后一个加入，轻轻混匀。移液枪吸取加入约2.0CM左右高度的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生

6、气泡。当浓缩胶上出现水层后表明聚合完成。再放置30－60min后可以使用。加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓冲液备用。储备液B储备液D储备液E储备液F储备液双蒸水TEMED总体积用量（ml）1.250.860ul52.916ul10配方表点样加样样品迁移方向电泳电压和电流：浓缩胶电压100v，分离胶电压180V.电流流18－30mA溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。大约2-3个小时夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳缓冲液加在槽中的样品分子量小分子量大电源电泳示意图电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤

7、中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子乳酸脱氢酶染色剂的配制乳酸钠0.5mlNAD25mgPMS2mgNBT15mg0.2MTris－Hcl溶液（PH8.0）10ml去离子水定容至50ml染色与观察将胶从中间切成2块，各自切去一个小角（作为标记），去离子水轻轻从玻璃板上吹下，置于大培养皿中，去离子水浸洗之后倒入染染色剂浸没，避光于37度摇床中染色30min。观察拍照思考题：根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？哪些过程中是为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？谢谢