质粒DNA的提取及检测.ppt

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1、质粒DNA的提取及检测质　粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1~n个）松弛型复制（20个以上）常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19(500~700Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要

2、去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA质粒的检测——凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第一部分　质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。二、实验原理碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取

3、的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。三、实验材料、器具及药品实验器具微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器。实验材料含PUCm-T的E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。实验药品1.LB培养基配制及分装(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeastextract)5gNaCl10gpH7.5121℃，20min高压灭菌2.溶液溶液Ⅰ200ml50mmol/L葡萄糖1.98

4、g25mmol/LTris-Cl(pH8.0)5ml1M10mmol/LEDTA(pH8.0)5ml0.4M溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH2%SDS临用前1:1混合贮存液即为II液.溶液Ⅲ5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml(最终pH4.8)3.分离液酚/氯仿/异戊醇＝25:24:14.无水乙醇5.70%乙醇6.无菌水各试剂的作用：溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA平衡酚：

5、氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA四、实验步骤接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室

6、温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀

7、、离心）12000rpm，离心10min沉淀超净台中风干沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存第二部分　琼脂糖凝胶电泳相关知识电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。

8、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度0.3　0.6　0.7　0.9　1.2　1.5　2.0线状DNA大小/kb5-60