第四节营养缺陷型菌株的筛选.ppt

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1、诱变育种诱变剂诱变育种步骤物理诱变剂化学诱变剂出发菌株的选择单孢子悬液的制备菌丝尖端法处理菌落周围的尖端菌丝混合培养法原生质体是异质的不具有细胞壁不产孢子的菌株诱变时会有遗传分离或遗传不稳现象诱变处理诱变剂种类选择最适诱变剂剂量的选择诱变剂的处理方式影响突变率的因素1、菌种的遗传特性不同2、菌体的细胞壁结构不同3、环境条件的影响①诱变前预培养和诱变后培养②温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响③平皿密度效应第三节营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。营养缺陷型的

2、用途一、基本概念二、筛选营养缺陷型的步骤（一）诱变（二）淘汰野生型（三）检出缺陷型（四）确定生长谱1、野生型菌株（wildtypestrain）2、营养缺陷型（auxotroph）：指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。3、原养型（prototroph）：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上相同。一、基本概念：与之有关的培养基有三类1、基本培养基(MM)：minimalmedium能满足野生型菌株正常生长的培养基；[-]2、完全培养基(CM)：completemediu

3、m能满足各种营养缺陷型营养要求的天然或半合成培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基；[+]3、补充培养基(SM)：supplementalmedium在基本培养基中加入相应的营养成分；[A][B]二、筛选营养缺陷型的步骤诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱（一）诱变方法用于诱发营养缺陷型的诱变剂有：亚硝基胍紫外线亚硝酸1、抗生素法：原理：一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。2、菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。3、高温杀菌法：利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异。（二）淘汰野生型MMCMCMMMMM

4、CM加青霉素（三）缺陷型的捡出原理：缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法夹层法、限量补充法无营养缺陷MMMM+FCM其他营养缺陷F营养缺陷（1）将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。（2）完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。（3）将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。１、影印法（4）将CM和MM在恒温箱中培养。（5）二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能

5、是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。MMCM２、点种法用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况。此法结果明确，但工作量大。CMCMMM３、夹层法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。基本琼脂培养基含菌的MMCM该法有两种情况：（1）目的是捡出营养缺陷型方法是将富集培养后的细胞接种

6、到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。（2）目的是定向筛选某种特定的缺陷型在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质。４、限量补充法