细菌营养缺陷型的诱变和筛选.docx

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1、微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺

2、陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、

3、夹层培养法和青霉素浓缩法等。影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。再经培养后出

4、现的菌落，多数是只能在完全培养基上生长的营养缺陷型。青霉素浓缩法：利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被杀死，得以浓缩。本实验采取的筛选方法就是青霉素浓缩法。诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱

5、；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。在诱发突变中，有两类诱变剂被使用：物理的和化学的。物理诱变中应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射等物理因素诱发变异。近年来又开发了一些新的物理诱变手段，如激光辐射诱变、离子注入诱变、空间诱变等。化学诱变剂在染色体中通过直接的化学作用发挥它们的功能，主要有①烷化剂，如甲基磺酸乙酯(EMS)、、亚硝基乙基脲烷(NEU)、硫酸二乙酯(DES)等，它们含有一个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改

6、变；②核酸碱基类似物，如5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudR)等，为一类与DNA碱基相类似的化合物，渗入DNA后，可使DNA复制发生配对上的错误；③抗生素，如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从而可造成染色体断裂。本实验使用的是紫外线诱变，紫外线诱变处理的有效波长为200-300nm，最适波长为254nm(此为核酸的最高吸收峰)。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子易形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。

7、另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。需要注意的是诱变要在暗箱中进行，为了防止DNA的光修复作用。经过诱变处理的菌株，还需要进行营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化等步骤才能获得想要的营养缺陷型菌株。本实验使用紫外线来诱发突变，并采用青霉素法淘汰野生型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。材料与方法1、材料（1）实验菌种E.coilK12SF+（2）培养基LB液体培养基：酵母粉0.5克，蛋白胨1.0克，NaCl1.0克，蒸馏水100毫升，pH7.2

8、LB固体培养基：LB液体培养基100毫升，琼脂粉2.