2-核黄素定量测定法课件.ppt

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1、荧光光度法定量测定核黄素方法一实验原理核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物。在水及乙醇的中性溶液中为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应式见讲义.另外,核黄素的激发光波长范围约为440—500nm(一般规定为440nm),发射光波长范围约为510—550nm(一般规定为520nm)。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度呈正比，由还原前后的荧光差数可以进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。二实验目的

2、和要求（1）、了解荧光法测定核黄素的原理和方法。（2）、学习荧光光度计的操作和使用。（3）、掌握荧光定量分析的工作曲线。三实验主要仪器与器材3-1、实验仪器：(1)、荧光光度计(2)、混合器（3）、天平（4）、水浴锅3-2、实验器材(1)、容量瓶(2)、试管架(3)、试管（4）、自动取液器（5）、烧杯（6）、量筒（7）、称量纸（8）、吸水纸（9）、骨勺（10）、保鲜膜（11）、标签纸或记号笔四试剂与配制4-1、试剂(1)、连二亚硫酸钠（保险粉）(2)、核黄素(3)、醋酸4-2、试剂配制(1)、连二亚硫酸钠（保险粉），直接用.(2)、36%醋酸溶液的配制：取冰醋酸36.0毫

3、升,用蒸馏水稀释至100.0毫升，混匀即可。(3)、核黄素标准品母液（10.0ug/ml）的配制：准确称取核黄素10.0毫克，放入预先装有50.0毫升蒸馏水的1000.0毫升容量瓶中，加入5.0毫升36%醋酸溶液，再加约800.0毫升蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温,用蒸馏水再定容至1000.0毫升，混匀即可。五操作步骤与结果5-1荧光测定方法（1）、选用滤色片核黄素荧光测定的激发光波长为455nm，选用带普通型400nm滤色片为激发光滤色片发射波长为523nm，选用截止型510nm滤色片为发射光滤色片.（2）、调仪器满刻度待仪器预热后，用2.5ug/ml（含

4、量最高的）的溶液调荧光光度计相对荧光强度，既调读数到满刻度（100%），反复多次，直至数据稳定为止。调好的满刻度，在整个实验结束之前，不可随意重调满刻度。（3）、标准品和样品测定A、未还原时标准品和样品溶液荧光强度的测定（F1）从高浓度到低浓度依次测定,并记录各自的读数于表1中,测定完后必需重新倒回到各自的原试管内,供样品溶液还原用.B、还原后标准品和样品溶液荧光强度的测定（F2）分别加入连二亚硫酸钠（保险粉）约10.0毫克,经溶解混匀后，再重新测其各自荧光强度，并记录读数于表1中,在测定中如果样品溶液的荧光强度超出100%，则需要重新稀释。仪器预热20分钟.5-2数据处

5、理每一个测定溶液的实际荧光强度校正公式为（F值见上表1）F=F1-F2F:校正后的实际荧光强度F1：未还原时测定的荧光强度F2：还原后测定的荧光强度5-3核黄素标准品母液与样品溶液的配制(1)、核黄素标准品溶液的配制：用核黄素标准品母液（10.0ug/ml），按下表1稀释成六种不同浓度的标准品溶液(2)、核黄素样品溶液的配制:将被测核黄素样品参照标准溶液的含量范围和溶剂体系配成测定溶液于表1中。对于食物和生物材料中的核黄素测定，一般需要事先经过抽提，或经过分离、纯化处理。5-4核黄素标准品溶液的配制方法与结果表1_标准品和样品溶液稀释方法及测定结果表步骤管号012345

6、样品标准品母液（ml）2.52.01.51.00.50.25蒸馏水（ml）7.58.08.59.09.59.75总体积（ml）10.010.010.010.010.010.0核黄素含量（ug/ml）2.52.01.51.00.50.25未还原时荧光强度F1还原后荧光强度F2实际荧光强度F5-4核黄素标准品溶液的配制方法与结果表1_标准品和样品溶液稀释方法及测定结果表步骤管号123样品标准品母液（ml）2.51.50.5蒸馏水（ml）7.58.59.5总体积（ml）10.010.010.0核黄素含量（ug/ml）2.51.50.5未还原时荧光强度F1还原后荧光强度F2实际

7、荧光强度F5-5标准曲线制作方法以表1中记录的标准溶液校正后的实际荧光强度为纵坐标，相应的含量为横坐标，作出核黄素测定的标准工作曲线，如下图1。核黄素标准工作曲线5-6样品含量的确定表1样品溶液校正后的实际荧光强度在标准曲线上，查出相应的样品含量为:ug/ml一定要有文字表达的结果……六讨论云云……思考题1、紫外、可见分光光度法和荧光分光光度法有何不同，为什么？2、在测定核黄素含量时，加还原剂-保险粉（连二亚硫酸钠），有何意义？不加有何后果？