生物活性测定法ppt课件.ppt

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1、生物活性测定法生物药物分析测定方法重组人促红素体内生物学活性测定法(网织红细胞法)本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红细胞生成的作用，给小鼠皮下注射EPO后，其网织红细胞数量随EPO注射剂量的增加而升高。利用网织红细胞数对红细胞数的比值变化，通过剂量-反应平行线法检测EPO体内生物学活性。试剂(1)乙二胺四乙酸二钾抗凝剂称取乙二胺四乙酸二钾100mg，加生理氯化钠溶液10ml溶解，混匀，使用时新鲜配制。(2)稀释液取0.1g牛血清白蛋白，加生理氯化钠溶液溶解并稀释至100ml，即得。标准品溶液的制备按标准

2、品说明书，将EPO标准品复溶，用稀释液将EPO标准品稀释成高、中、低3个剂量EPO标准溶液。供试品溶液的制备用稀释液将供试品稀释成高、中、低3个剂量与EPO标准溶液单位相近的供试品溶液。测定法按低、中、高(如10IU／鼠、20IU／鼠、40IU／鼠)3个剂量组，分别给近交系6～8周龄小鼠(雌性BALB／c小鼠)或B6D2F1小鼠皮下注射EPO标准品及供试品溶液，每组至少4只，每鼠注射量为不大于0.5ml。在注射后的第4天从小鼠眼眶采血3～4滴，置于预先加入200ulEDTA-K2抗凝剂的采血管中。取抗凝血，用

3、全自动网织红细胞分析仪计数每只小鼠血液中的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret％)。按注射剂量(IU)对Ret％的量反应平行线测定法(二部附录XIV)计算供试品体内生物学活性。本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。干扰素生物学活性测定法(细胞病变抑制法)试剂(1)MEM或RPMIl640培养液取MEM或RPMI1640培养基粉末

4、1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。(2)完全培养液量取新生牛血清10ml，加MEM或RPMI1640培养液90ml。4℃保存。(3)测定培养液量取新生牛血清7ml，加MEM或RPMI1640培养液93ml。4℃保存。(4)攻毒培养液量取新生牛血清3ml，加MEM或RPMI1640培养液97ml。4℃保存。(5)消化液取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷

5、酸二氢钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃15分钟灭菌。(6)染色液取结晶50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml，即得。(7)脱色液取无水乙醇50ml、乙酸0.1ml，加水稀释至100ml。(8)PBS取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃15分钟灭菌。标准品溶液的制备取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每lml含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列

6、稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。供试品溶液的制备将供试品接标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。测定法使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1︰2～1︰4传代，每周2～3次．于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每lml含2.5×105～3.5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100ul。于37℃、5％

7、二氧化碳条件下培养4～6小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100ul。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培养液稀释至100CCID50，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50％病变点在lIU/m1)。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加染色液50ul，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100ul，室温放

8、置3～5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果：Ds×Es供试品生物学活性(IU/m1)=Pr×Dr×Er式中：Pr为标准品生物学活性，IU／ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。本法系根据在不同