课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (3).pptx

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1、课题背景尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只有被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用脲酶CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3课题2土壤分解尿素的细菌的分离与计数1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌课题目的一、研究思路(一)筛选菌种1实例：寻找耐高温的DNA聚合酶启示：PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。寻找目的菌种时要根据它对_______________，到相应的环境中去寻找。生存环境的要求耐高温的酶耐高温生物体耐高温环境（热泉、火山口）寻找寻找Ta

2、q细菌筛选原因:因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。2实验室中微生物的筛选原理人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。思考:1.该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素2.从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？固体培养基选择培养基此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。3选择培养基：在微生物学中，将允许______________

3、________，同时_________________________生长的培养基。特定种类的微生物生长抑制或阻止其他种类微生物结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。如何对细菌进行计数？1显微镜直接计数：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。1.显微镜直接计数(1)原理:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)具体做法：（3）优缺点：缺点：不能区分死菌和活菌。优点：能准确统计微生物的实际数目。每一个大方

4、格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，一个大方格中的总菌数是多少?5A1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）5AB×1041mm2稀释涂布平板法（间接计数）101102103104105106(二)统计菌落数目方法运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。原理1个菌落←1个活菌①选择菌落数在30～300的平板上计数。②需培养计算出三

5、个或三个以上的平板菌落,求平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。注意事项看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板）第二位同学：A组结果误差过大，不应用于计算平均值计算公式：某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B每克样品中的菌株数=（C÷V）×M(三)设置对照实验阅读P22～23页“（三）设置对

6、照”一段讨论教材中提出的问题。设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。(1)A同学出现此结果的可能原因？⑴土样不同⑵培养基污染(或混入了其他的含氮物质)(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明______；如果结果不同，则证明A同学存在

7、__________________A无误培养基的配制有问题实验流程：样品稀释涂布平板微生物的培养与观察菌落计数二、实验设计土壤取样制备培养基（一）土壤取样从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。“微生物的天然培养基”数量最大、种类最多大约70%—90%是细菌（二）制备培养基制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了

8、选择作用。（对照作用）思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？（三）样品稀释涂布平板稀释倍数为101～106。每个稀释度均用3个选择培养基和1个蛋白胨培养基。（四）微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录