高级生物化学.doc

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1、有效成分：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。有效成分具有含量少和稳定性差的特性。固定相：固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂（即推动有效成分或杂质向一定方向移动的溶液）。在薄层层析时流动相又称展层剂。层析：以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物

2、得到分离。操作容量：即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克（或每毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）来表示。其数值越大，表明基质对某种成分的结合力越强；否则反之。床体积（Vt）：通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）Vt是基质的外水体积（V0）和内水体积（Vi）以及自身体积(Vg)的总和，即Vt=V0+Vi+Vg。洗脱体积（Ve）：洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。外水体积(V0)：外水体积是指基质颗粒之间体积的总和。内水体积（Vi）：内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。

3、基质体积（Vg）：基质体积是指基质自身所具有的体积。V0、Vi和Vg都是随着床体积和基质性质的变化而变化的。膨胀度：在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示，即每克溶胀基质所具有的床体积。一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。分配系数是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。而迁移率是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。几种物质之间的分配系数或迁移率的差异程度，是决定它们采用层析方法能否分离开的先决条件

4、。其差异程度越大，分离效果就越好。疏水层析:疏水作用层析，它是根据有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，进而设法将有效成分分离出来。反相层析：是有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，分离纯化小分子质量的肽类和辅基等物质的方法，所用的载体结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质物质具有较大吸引力。凝胶过滤又叫分子筛层析，其原理在于凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质被排阻在外，当一混合溶液通过凝胶层析柱时，溶液中的物质就按分子质量筛分开了。亲和层析是利用生物大分子的特异的生物学性质—专一地对某一种或某一类物质可通过次级键结合的特性（亲和特性）进行纯化

5、的方法，与层析法结合起来就是亲和层析法。亲和层析法使生物大分子的提纯变得简单、迅速和高效。双水相体系：将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相溶的两相，构成双水相体系。常用双水相体系：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dextron）、PEG/磷酸盐6生物大分子物质制备基本原则：防止生物分子变性、降解1．控制适当的pH；2．控制低温；3．注意提取过程中的溶液环境（成分的变化）；4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基材料选择原则：含量多、稳定性好，来源丰富、保持新鲜，工艺简单、有利用价值。常用的测定方法：光谱法（紫外光谱法、可见光谱法、荧光法

6、、浊度法）、电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感器。测定核酸含量：当A260=1时，双链DNA50μg/ml、单链DNA37μg/ml、单链RNA40μg/mlA260/A280:纯DNA=1.8，纯RNA=2.0细胞的破碎：机械破碎、溶胀和自溶、化学处理、生物酶降解抽提有效成分的影响因子：pH值、溶剂的极性和离子强度（蔗糖、、水解酶、温度、搅拌、氧化（巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素C、多酚氧化酶）、金属离子、抽提液与抽提物的比例（5:1）盐析的影响因子：盐析常数Ks、盐分级范围的差异性、pH和盐浓度、蛋白质的纯度和浓度（0.2-2%）共沉淀现象离子交换剂由三部分组

7、成：基质+电荷基团+反离子根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类：1．疏水性离子交换剂2．亲水性离子交换剂交联度：交联剂在基质中所占百分数离子交换剂的影响因子：交联度大，网孔小，膨胀度小，吸水量小。亲水性基质膨胀度大交换剂的电荷强度强，膨胀度大带同种电荷或解离度大时（pH远离pK）膨胀度大交联度越大，各因素影响越小交换容量总交换容量：配体实际数量决定，与测定条件无关有效交换容量：可用配体数决定，与测定条件有关影响交换容量的因素：筛孔、离子强度、pH值离子交