高级生物化学实验指导

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1、高级生物化学实验指导四川农业大学生化研究室二零一二年十月目录实验一猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳……………………………………………..1实验二蛋白质分子量测定--------凝胶层析法…………………8实验三纳米磁珠法小规模提取质粒DNA及纯化鉴定………18实验四DNA的琼脂糖凝胶电泳………………………………21实验一猪血中超氧化物歧化酶(sod)的分离纯化及活力测定、同工酶电泳一、原理超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）是一种能专一地清除超

2、氧离子自由基（O2-）的金属酶,他具有抗衰老.抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药化妆品、食品工业等方面具有了广泛地应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu---Zn---SOD、Mn---SOD、Fe----SOD等三种。Cu---Zn---SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn---SOD呈紫红色；Fe----SOD呈褐色。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。机构内0-的过量和不足均对集体不利，SOD对过量的02-的及时

3、清理保证了集体内02-的含量相对平衡。集体内的O2-的形成可病理性和生理性两方面。在一些正常的生理过程中形成一些02-。例如：呼吸链中电子传递结果可以产生一些O2-。在某些疾病的过程产生大量02-如不及时清理，会对细胞损伤。SOD将02-，歧化为H202，而过氧化酶、股胖肝泰过氧化酶可以催化过氧化氢分解，在集体内形成一套解毒系统，对集体起防护作用。本实验采用邮寄溶剂沉淀方法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并惊醒纯化。酶活力测定可用以下方法；邻苯三分自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法

4、、肾上腺自氧化法、亚硝酸法等。该实验sod酶活性采用邻苯三分自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应中，每分钟抑制邻苯三分氧化速率达50%的酶含量定义为一个酶的单位。样品中的蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯蓝G-250CoomassicbrilliantblueG-250）在在游离状态下呈紫色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000ug。SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“

5、负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自①由基）能使氯化硝基四氮嗟蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布及活性大小）。二、实验试剂与器材[试剂]1.SOD的提取①ABC抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml.②0.9%NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中。③丙酮④95%乙

6、醇⑤氯仿1.SOD活力测定①50mmol/LpH8.3磷酸缓冲液②10mmol/LEDTA钠盐溶液③3mmol/L领苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制）2.考马斯亮蓝G-250法测蛋白质①考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。②标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为

7、100ug/ml的标准蛋白质溶液。3.SOD同工酶鉴定①40%蔗糖[w/v]：称取40g蔗糖加重蒸水100ml。②10%过硫酸铵[Ap]：称过硫酸铵10g，溶于100ml重蒸水中。用时现配。③电极缓冲液：称取三时配羟甲基氨基甲烷6g，甘氨酸28.8g。用蒸馏水溶解并定容至1000ml，过滤后装入棕色瓶，4℃保存。④30%的Acr—Bis溶液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸馏水溶解，定容至100ml，过滤后装入棕色瓶，4℃保存。⑤Tris-HCL，ph6.7缓冲溶液：Tris6.0g，加入1m

8、ol/LHCL48ml，TEMED0.4ml,用浓盐酸调PH8.9后，再用蒸馏水定容至100ml。⑥Tris-HCI，PH6.7缓冲溶液：Tris6.0g,加1mol/LHCL48ml,TEMED0.4ml,用浓盐酸调至PH6.7后，再用蒸馏水定容至100ml⑦NBT溶液：核黄素吗（0.01%），氯化硝基四氮嗟蓝（NBT）（25mol/L），磷酸缓冲液（0.05mol/L）、PH7.8），EDTA-Na2（1.0mol/L）。⑧2.8×10（3）mol/L的EDTA-