RT-PCR试剂盒说明书

《RT-PCR试剂盒说明书》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、RT-PCR试剂盒说明书公司：TIANGENOrder:010-59822688Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD版本号：KR121221TIANScriptRTKitTIANScriptcDNA第一链合成试剂盒目录号：KR104产品内容：产品组成KR104-0125rxnKR104-02100rxnTIANScriptM-MLV(200U/μl)25μl100μlOligo(dT)15(10μM)60μl240μlRandom(10μM)60μl240μ

2、l5×First-StrandBuffer150μl500μlRNase-FreeddH2O1ml2×1mlSuperPuredNTPs(2.5mMeach)60μl240μlRNasin(40U/μl)15μl2×30μl储存条件：-20℃保存。产品介绍：TIANScriptRTKit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly(A)+RNA合成第一链cDNA。与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆

3、特定基因的cDNA片段等。产品特点：合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScriptM-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。注意事项：1.用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。2.RNA样品要避免基因组DNA污染。3.避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。4.试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。5.cDNA产物应

4、置于-20℃保存。操作步骤：1.在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5μg总RNA或50-500ngmRNA；2μloligo(dT)15或2μlRandom或2pmol基因特异引物；2μlSuperPuredNTPs(2.5mMeach);补RNase-FreeddH2O定容至14.5μl。2.70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min。简短离心收集反应液后加入以下各组分：4μl5×First-StrandBuffer(含有DTT)；0.5μlRNasin。3.加1μl（200U）TIANScriptM-MLV，轻轻用移液器混匀。如果

5、用随机引物，请将离心管置25℃温浴10min。4.42℃温浴50min。5.95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冰冻保存。如果需要RNaseH处理，进行步骤6。否则，进行步骤7。6.加RNaseH1μl(2U)，37℃温浴20min以降解RNA。然后95℃加热5min使酶失活。7.用RNase-FreeddH2O将反应体系稀释到50μl，取2-5μl进行PCR扩增反应。PCR反应：应吸取10%的第一链反应液（2μl）进行PCR反应；即使加入更多量的第一链反应液也不能增加其扩增的产物量，反而可能会抑制正常的PCR反应。1.请将以下成分加入到

6、一PCR管中并使其终反应体积为50μl：组成成分体积10×PCRBuffer5μlTaqDNApolymerase(5U/μl)0.4μl10mMdNTPsmix1μl50mMMgCl21.5μl扩增引物1（10μM）1μl扩增引物2（10μM）1μlcDNA(第一链反应)2μlddH2O38.1μl总体积50μl注：为了得到最好结果，MgCl2最适浓度应依不同的模板-引物对而定2.94℃加热变性2min。3.设置15到40个PCR循环。退火与延伸条件依引物和模板而定。