基因工程6转基因体的检测.ppt

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1、第五章：转基因体的鉴定验证‣外源基因是否进入受体细胞？‣进入受体细胞的外源基因是否整合到染色体上？‣整合的方式如何？‣整合到染色体上的外源基因是否表达？这一系列的问题仍需回答，只有获得充分的证据后才可队定被检的材料是转基因的。外源基因整合的分子生物学鉴定主要有PCR扩增、PCR-Southern杂交、Southern杂交以及Southern原位杂交和FISH等。一、外源基因整合分子生物学鉴定1利用PCR扩增检测外源基因整合※以被检植株DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增。※琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，若被检植株基因组DNA中含有

2、外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。反之，非转化植株无特异性扩增条带出现。通过特异性扩增条带的有无及其分子量的大小可对外源基因是否整合做一初步判断。斑点杂交可以快速粗略地检测一下植物基因组内是否含有外源基因。2Southern斑点杂交操作过程：植物总DNA或基因组DNA不经限制性内切酶酶切，直接点在固相膜上。点样前DNA样品需经变性处理，一般做法是采用NaOH碱变性，也可以通过煮沸变性。轻微洗膜除去盐后进行固定，以后的操作与印迹杂交相同。斑点杂交的主要问题是假阳性率较高。斑点杂交虽可以简便快速地检测植物染色体

3、DNA中是否含有目的基因及大致的量，但不能反映外源基因整合的更多信息。3Southern印迹杂交Southern印迹杂交由Southern于1975年建立，用来检测经限制性内切酶切割的植物DNA片段中是否存在与探针同源的序列，并可分析外源基因在植物染色体上的整合情况，如拷贝数、插入方式以及外源基因在转化植株Tl代中的稳定性等问题。将被检植株的基因组DNA提取出来，用限制性内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有外源基因片段或含外源基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝胶上。1）Southern印迹杂交原理用碱

4、处理凝胶，使各酶切片段在凝胶上原位变性，利用印迹技术将变性的各酶切片段由凝胶转移到固相膜上，各片段在固相膜上的相互位置与在凝胶上相同，实现所谓的原位印迹。经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与固相膜牢固结合。经预杂交处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点后，将膜放入含有单链或经变性处理成为单链探针的杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。膜上与探针同源的单链序列，可通过碱基互补作用与探针杂交成双链，从而使探针固定在相应位置上。外源基因与探针同源，凡含有外源基因序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异性杂交体。漂洗除去非特异性的结合及未结合的游离

5、的探针。最后根据探针的标记性质进行检出，特异性杂交体的数量及位置将清晰而准确地显示出来。实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子量标准DNA样品及待检转化植株总DNA样品。2）Southern印迹杂交的实验样品※阳性对照样品：①含被检的外源基因的中间载体质粒DNA；或②农杆菌共整合载体的Ti质粒DNA；或③农杆菌双元载体小质粒DNA。※阴性对照样品：用相同方法提取的非转化植株总DNA。※分子量标准DNA样品：DNA／HindⅢ、或DNA／HindIII+EcoRI。※被检样品：各转化克隆植株总DNA。3）Southern印迹杂交的实验

6、程序Southern印迹杂交需要依次完成如下8个实验步骤：①植物总DNA的限制性酶切；②凝胶电泳分离各酶切片段；③各酶切片段于凝胶中原位变性；④将凝胶中变性的DNA片段转移到固相膜上；⑤预杂交，掩盖非特异性位点；⑥探针与膜上同源DNA片段杂交；⑦漂洗去除未结合的及非特异性结合的探针；⑧杂交体检出。各程序中有关问题阐述如下：①植物总DNA的限制性酶切*限制性内切酶的选择多数情况是对植物基因组DNA进行单酶切，也可进行双酶切。酶的选用原则是消化后生成的DNA片段可提供出与探针杂交所需的足够信息，即限制片段中必须含有整个探针序列。②酶切反应体

7、系*植物DNA的用量一般在5～15µg；*酶切体积为20一50µl；*酶的用量要比消化质粒DNA时高一些，一般为5～10U/µgDNA。Notice:限制性内切酶是保存在50％的甘油中，如果酶切反应体系中甘油浓度超过5％，则会引起限制性内切酶专一性改变，产生星活性。③酶切效果检验酶切体系及条件是否合适，需通过检测酶切效果来确定。酶切充分的植物DNA产生若干大小不同的片段。将酶切样品用0.7％或0.8％的琼脂糖凝胶分离，电泳后在紫外灯下观察，酶切效果好的样品应呈现出一条连续的，荧光由深至浅的均匀条带(高分子量区深，低分子量区浅)。④凝胶中

8、的DNA变性Southern杂交必须是单链探针与单链同源DNA片段结合，因而凝胶上的双链DNA片段必需经变性处理，使之成为单链。通常采用碱变性，将凝胶浸泡在0.5mol／LNaOH、1.5mol/LNaCl