基因工程6转基因体的检测

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1、第五章：转基因体的鉴定验证‣外源基因是否进入受体细胞？‣进入受体细胞的外源基因是否整合到染色体上？‣整合的方式如何？‣整合到染色体上的外源基因是否表达？这一系列的问题仍需回答，只有获得充分的证据后才可队定被检的材料是转基因的。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.外源基因整合的分子生物学鉴定主要有PCR扩增、PCR-Southern杂交、Southern杂交以及South

2、ern原位杂交和FISH等。一、外源基因整合分子生物学鉴定Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.1利用PCR扩增检测外源基因整合※以被检植株DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增。※琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，若被检植株基因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。反之，非转化植株无特异性扩增条带出现。通过特异性扩增条带的有无及其

3、分子量的大小可对外源基因是否整合做一初步判断。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.斑点杂交可以快速粗略地检测一下植物基因组内是否含有外源基因。2Southern斑点杂交操作过程：植物总DNA或基因组DNA不经限制性内切酶酶切，直接点在固相膜上。点样前DNA样品需经变性处理，一般做法是采用NaOH碱变性，也可以通过煮沸变性。轻微洗膜除去盐后进行固定，以后的操作与印迹杂交相

4、同。斑点杂交的主要问题是假阳性率较高。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.斑点杂交虽可以简便快速地检测植物染色体DNA中是否含有目的基因及大致的量，但不能反映外源基因整合的更多信息。3Southern印迹杂交Southern印迹杂交由Southern于1975年建立，用来检测经限制性内切酶切割的植物DNA片段中是否存在与探针同源的序列，并可分析外源基因在植物染色体上的整

5、合情况，如拷贝数、插入方式以及外源基因在转化植株Tl代中的稳定性等问题。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.将被检植株的基因组DNA提取出来，用限制性内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有外源基因片段或含外源基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝胶上。1）Southern印迹杂交原理用碱处理凝胶，使各酶切片段在凝胶上原位变性，利用印迹技术将

6、变性的各酶切片段由凝胶转移到固相膜上，各片段在固相膜上的相互位置与在凝胶上相同，实现所谓的原位印迹。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与固相膜牢固结合。经预杂交处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点后，将膜放入含有单链或经变性处理成为单链探针的杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。膜上与探针同源的单链序列，可通过碱基互补作用与探针杂交成双链

7、，从而使探针固定在相应位置上。外源基因与探针同源，凡含有外源基因序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异性杂交体。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.漂洗除去非特异性的结合及未结合的游离的探针。最后根据探针的标记性质进行检出，特异性杂交体的数量及位置将清晰而准确地显示出来。Evaluationonly.CreatedwithAspose.Slidesfor.NET3.

8、5ClientProfile5.2.0.0.Copyright2004-2011AsposePtyLtd.实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子量标准DNA样品及待检转化植株总DNA样品。2）Southern印迹杂交的实验样品※阳性对