干细胞的培养条件和培养基.pdf

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1、干细胞的培养条件1.培养条件1.环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。2.设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。3.实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。4.试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。5.试剂的配制：1.DMEM培养基:去离子水中含1.34%DMEM粉末、0.22%NaHCO32.MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS,1000u/ml青霉素,1000

2、g/ml链霉素3.ES培养基:ES培养基：DMEM培养基中含15%FBS，1×106U青霉素，1×106g链霉素，1mM丙酮酸钠,0.1mM非必须氨基酸,2mM谷氨酰胺,0.1mM巯基乙醇,1000u/ml白血病抑制因子4.D-Hank's：0.8%NaCl,0.04%KCl,0.035%NaHCO3,0.006%KH2PO4,0.005325%Na2HPO4,0.001%酚红5.0.1%明胶:D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶6.ES细胞冻存液：90%ES培养基，10%DMSO7.MEF细胞冻存液：90%MEF培养基，10%DMSO8.Feeder细胞冻存液：90%FBS，10%D

3、MSO9.丝裂霉素C:根据产品说明书来配制2.培养步骤常见的干细胞培养是胚胎干细胞（EScells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。1.小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblasts，MEF）的复苏胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。1.在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。2.把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g，5min离心收集细胞。3.吸掉上清（除去冻

4、存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。4.根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。2.滋养细胞层（feedercellslayer）的制备1.把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。2.把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不

5、含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。3.用1mlMEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。4.去掉上清，用1mlMEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）5.一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养

6、基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。3.小鼠胚胎干细胞（mouseembryonicstemcells，EScells）的复苏1.在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。2.把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g，5min离心收集细胞。3.吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。4.根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。4

7、.小鼠胚胎干细胞的传代1.吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。2.用1mlES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。3.去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。5.小