层孔菌乙酸乙酯提取物的分离与纯化文献综述

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1、文献综述层孔菌乙酸乙酯提取物的分离与纯化一、选题的背景、意义目前，大量的研究证实多数层孔菌属的真菌多糖有较好的生物学活性，其中对裂蹄木层孔菌的研究较多[1]，它能够调节细胞免疫和体液免疫，而其抗肿瘤活性明显优于其他担子菌[2]。王稳航等首次对松木层孔菌子实体多糖的抗氧化性进行了研究．结果表明，多糖抗氧化效果较好，对超氧阴离子自由基的清除率达到90％以上，丙二醛生成抑制率达到65％左右[3]。目前国内外对松木层孔菌多糖结构的研究还未见报道．本文以发酵培养的松木层孔菌为材料，主要研究了碱提松木层孔菌菌丝体多糖的结构特点，并初步研究多糖对离体脾细胞增殖的影响，证明其对体外淋巴细胞增殖有显著作用[4

2、]。二、相关研究的最新成果及动态主要结果如下:1.通过形态学,生理生化特征，以ITs序列分析,对实验室前期分离到的层孔菌L8菌株进行了鉴定，确定其为木蹄层孔菌（GeneBankno.DQ513402）[5]。在明确菌种后，通过反复实验，构建了木蹄层孔菌L8的液体深层发酵培养方法,并优化了其发酵工艺。结果表明当发酵培养基组成为:葡萄糖5%,蚕蛹水解液1%，酵母粉0.5%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%；发酵条件为:温度25℃，初始pH5.0，转速100rpm，通气量1.0vvm,接种体积10%（v/v）,发酵周期6天时,层孔菌L8的菌丝生物量最大,可达18.11±1.08g/L,

3、是优化前的2.3倍[6]。另外从给药前后荷瘤鼠的体重变化也可以看出，层孔菌L8的发酵菌粉给药后,荷瘤鼠的体重比给药前都有所增加。以上结果表明层孔菌L8的发酵菌粉,在肿瘤治疗方面,具有潜在的开发价值[7]。2.采用体外人源的肿瘤细胞作为筛选模型,对10余种层孔菌进行了抗肿瘤活性评价和活性成分的分析,结果发现Hispolon为一些层孔菌中共有的一个活性成分,并发现Hispolon对许多肿瘤细胞表现出剂量依赖性的生长抑制作用,其中对胃癌细胞SGC-7901的活性较好，作用72h后的IC50低于10μg/mL[8]。3.利用动态荧光可视技术，流式细胞术，Western-blot等现代肿瘤细胞学和分子

4、药理学的技术和方法,深入研究了Hispolon诱导胃癌细胞死亡的分子机理。结果发现Hispolon可以诱导胃癌细胞发生一种特殊的ROS介导的线粒体途径的凋亡。该凋亡机制如下所述:Hispolon通过将细胞内的GSH驱逐出细胞外,使得细胞内的GSH含量下降;同时抑制细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶GPX的活性,使得胃癌细胞的抗氧化能力大大下降,从而导致ROS的急剧增加[9]。大量的ROS积聚引起了线粒体膜的氧化损伤，破坏了线粒体膜的完整性，导致线粒体膜的通透性增加，使得线粒体中的细胞色素C大量释放出来，激活了Caspase的级联反应,启动凋亡程序,最终引发细胞发生凋亡。相比之下,当Hispolon作

5、用正常的胃粘膜上皮细胞后,ROS并没有显著增加,细胞也没有发生明显的死亡。探索造成这种差异的原因时,我们发现胃癌细胞本身固有的ROS水平比正常的胃上皮细胞要高,这使得胃癌细胞对Hispolon更加敏感。[10]4.低剂量的Hispolon（2.5μg/mL）可以显著地增加化疗药物（丝裂霉素C,5-氟尿嘧啶,阿霉素）对胃癌细胞SGC-7901的杀伤性。并且这种增敏机制是通过引发胃癌细胞中的GSH急剧下降,导致了ROS的大量积聚,进而引发了细胞死亡。综上所述,本论文的研究结果为解决层孔菌类药用真菌的人工资源化问题,深入研究其活性成分的作用机制提供了一种思路和方法,并为层孔菌类药用真菌的新药创制提

6、供了一定的依据[11]。三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标1经水提的菌丝体残渣，烘箱干燥，称取5克干燥的松木层孔菌菌丝体，然后加入0.5mo1/LNaOH溶液，在一定温度下进行一定时间的提取，反复提取3次，合并提取液经过过滤加HCl中和，在水浴锅中浓缩至小体积，得浓缩液，透析，用3倍体积97％(质量分数)乙醇醇析得水溶性粗多糖沉淀，低速离心机离心，转3500,离心10分钟，弃去上清液，沉淀用无水乙醚洗涤2次，真空干燥后，得碱提水溶性粗多糖的产品[12]。2称取20.0g沙棘籽粕9份，分成3组,每组3份，按1:10的料液比分别入水、70％乙醇和70％丙酮，3

7、0℃下搅拌提取2h。丙酮提取的得率最高，为1．35％，而乙醇和水提取的得率基本相近，为1．00％和0．91％。丙酮的提取效果最佳，这一点与相关文献报道相符I9J。但是丙酮挥发性较强，在提取和浓缩时很容易损失，并且可能带来环境污染和产品有毒有机物残留。在保证一定得率的同时还要考虑成本和操作的难易程度，以及工业化生产实际需要，因此乙醇和水提取是可行的。从成本上考虑，水的成本最低并且使用方便，故本试验采用水作为提取