酵母菌的分离与纯化

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1、酵母菌的分离与纯化土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减

2、少其中菌相的变化。2面肥（1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。*以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。3水果果皮桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。（二）酵母菌的分离1制备菌悬液称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5

3、、10-6三个稀释度。2涂布法分离取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向

4、平板边缘或将培养基划破。3培养接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。4纯化用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。酵母扩培方案一、培养基制备(一)麦芽汁培养基的配制1．培养基成分新鲜麦芽汁一般为10-15波林。2．配制方法(1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。(2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取

5、0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。(3)糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。(4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6．4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。(5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。(6)分装、加塞、包扎。(7)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。（二)马铃薯葡萄糖培养基的配制1、培养基成分马铃薯

6、20g葡萄糖2g琼脂1.5-2g水100ml自然pH2．配制方法(1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100Pa灭菌20min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。（2)配制时，按每100m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。(3)分装、加塞、包扎。(4)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。(三)豆芽汁葡萄糟培养基的配制1．培养基成分黄豆芽10g葡萄糖5g琼脂1.5-2g水100ml自然pH2．配制方法(1)称新鲜黄豆芽1

7、0g，置于烧杯中，再加入100m1水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。（2)配制时，按每100m110％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化，补足失水。(3)分装、加塞、包扎。(4)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。(四)察氏(czapck)培养基的配制1．培养基成分蔗糖3gNaN030.3gK2HP040.1gKCl0.05gMgSO4·7H2O0.05gFeS040.001g琼脂1.5-2g蒸馏水100ml自然pH2．配制方法(1)称量及溶化量取所需水量约2／3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、

8、NaNO3、K2HP04、KCl、MgSO4。依次逐一加入水中溶解。按每100ml培养基加入1ml0.1％的FeS04溶液