植物细胞骨架的光学显微观察.ppt

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1、五、植物细胞骨架的光学显微观察一、实验目的通过光学显微镜观察细胞骨架的结构，并掌握显示植物细胞骨架的方法及原理。二、实验原理细胞骨架是指真核细胞中与保持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络。包括微管、微丝和中间丝。TritonX-100：是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)，1%的TritonX-100常用于漂洗组织标本。在细胞骨架的观察实验中，采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。三、实验用品(一)器材：显微镜、50m

2、l烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。(二)试剂：1．M一缓冲液：50mmol／L咪唑，50mmol／LKCl，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙二醇双(a-氨基乙酸)醚四乙酸)，0.1mmol／LEDTA，lmmol／L巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)。2．6mmol／LPH6．8磷酸缓冲液。3．1％TritonX-100，用M-缓冲液配。4．0.2％考马斯亮蓝R250，其溶剂是甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46.5ml。5．3％戊二醛，用6mmol／L磷酸缓冲液(PH6．8)配制。6．5％、7％、95％乙醇。7．叔丁醇、正丁醇、二甲苯

3、、树胶。(三)材料：洋葱鳞茎。四、实验方法(一)取洋葱鳞茎内表皮细胞(约lcm2大小)若干片温于装有PH6．8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。(二)吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX-100处理20-30分钟。(三)吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗3次，，每次10分钟。(四)3％戊二醛固定0.5-1小时(对照组开始处理)。(五)PH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10分钟。(六)用0.2％考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。(七)用蒸馏水洗1-2次，材料置于载玻片上，加盖玻片，即可镜检。(八)如作永久制片，可使样品顺序通过如下试剂：50％乙醇，70％乙醇，

4、95％乙醇，95％乙醇和叔丁醇混合液(1：1)，每次5-10分钟，或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯，每次5-10分钟。然后捞取样品，平展于载玻片上，中性树胶封固。光学显微镜下洋葱内表皮细胞的轮廓清晰可见，细胞壁及其分界明显。10×10倍镜下可粗略观察到细胞内粗细不等的蓝色纤维、团块形成的网状结构。同一细胞内各处骨架的密集度不均匀，细胞核区域的纤维相对密集，蓝色浓重，甚至分辨不出网络结构，另外可见细胞壁区域有零星蓝色纤维分布；相邻细胞的密集程度基本一致，但有少数细胞有较大不同。10×40倍镜下可清楚观察到蓝色的网状结构确实由线性纤维交织成，纤维间的结合点稍膨大。细胞边缘骨架

5、较稀疏，但可见由与胞壁相同走向的纤维形成的细胞质膜的轮廓，与细胞内部的纤维通过纵向的纤维相连。相邻细胞有纤维穿过胞间的细胞壁。调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化，表明细胞骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。