第六章 外源基因在大肠杆菌中的表达.pdf

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1、生物技术专业核心课程生物技术专业核心课程基因工程基因工程华东理工大学华东理工大学张惠展张惠展基因工程1重组重组DNADNA技术与基因工程的基本概念技术与基因工程的基本概念2重组重组DNADNA技术与基因工程的基本原理技术与基因工程的基本原理3重组重组DNADNA技术所需的基本条件技术所需的基本条件4重组重组DNADNA技术的操作过程技术的操作过程5目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建6外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达7外源基因在酵母菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达8外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的

2、表达9外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化66外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达AA大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征BB外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理CC大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略DD基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策EE利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素66外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达AA大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受

3、体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物66外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达AA大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真

4、核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素66外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达BB外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数启动子启动子目的基因目的基因EEEE启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测AA目的基因目的基因AA酶切开酶切开EEEE启动子启动

5、子Bal31Bal31酶解酶解启动子启动子启动子的筛选启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的DNADNA片段片段终止密码子终止密码子ApAprr克隆到启动子探针质粒克隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上上pKO1pKO1galKgalK受体细胞染色体受体细胞染色体DNADNA上的上的galEgalE、、galTgalT与质与质粒上报告基因粒上报告基因galkgalk的表达产物联合作用，的表达产物联合作用，oriori可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化转化galEgalE++、、galTgalT+

6、+、、galKgalK--的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆启动子启动子启动子的构建启动子的构建启动子启动子-35-35区序列区序列-10-10区序列区序列PPTTGACATTGACAGATACTGATACTλλLLPPrecArecATTGATATTGATATATAATTATAATPPtraAtraATAGACATAGACATAATGTTAATGTPPtrptrpTTGACATTGACATTAACTTTAACTPPlaclacTTTACATTTACATATAATTATAATPPtactacTTGACATTG

7、ACATATAATTATAATPPtactac==33PPtrptrp==1111PPlaclac启动子启动子启动子的可控性启动子的可控性基底水平转录基底水平转录乳糖启动子乳糖启动子PPlaclac的可控性：的可控性：阻遏蛋白阻遏蛋白野生型的野生型的PPlaclac与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物PPOO存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基乳糖异丙基乳糖异丙基--ββ-D--D-硫硫诱导诱导代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG））底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱导物可以使启动子启动子PPl