柱效测定以及影响因素.pdf

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1、柱效测定以及影响因素柱效（columnefficiency）是色谱柱在色谱分离过程中主要由热力学因素(操作参数)所决定的分离效能。通常用理论塔板数、有效塔板数、理论塔板高度、有效塔板高度等表示。柱效是衡量色谱柱性能的一项主要指标，柱效越高，分离能力越强。折合的塔板高度h=HETP/d/P对称性As**达到最大峰高的时间（或洗脱体积）所对半峰高峰宽Wh应的停留时间（停留体积）。示踪物质浓度时间（洗脱体积V）停留时间（停留体积）相对峰宽通常用理论塔板（N），理论塔板数（HETP）或折合为塔板高度（h）来迚行描述：()σσ()对称因子As描述了与理想高斯峰形

2、状的偏差，通过对10%峰高处的峰宽迚行计算得到：术语塔板数N平均停留时间*μ1方差*σ2停留时间**tR停留体积**VR半峰高峰宽Wh床高L颗粒半径d/P理论塔板数HETP最佳柱效对于生物过程色谱中使用的有孔介质，其最佳柱效时实验测定的塔板高度h小于等于3。就峰的对称性而言，理想对称性为接近As=1。当工作中折合塔板高度h≤3时，一般能接受的范围通常在0.8-1.8之间。需要谨记的是以柱宽而言，柱效越低通常意味着峰对称性越好。或者以N/m（每米的理论塔板）来表示，对于不同颗粒大小的填料，达到以下的数值，即可认为柱效比较好：颗粒大小（μm）介质实例N/m

3、As15SOURCE™15~200000.8~1.530SOURCE30~110000.8~1.534SepharoseHighPerformance,〉100000.8~1.8Superdex™，Superose〉100000.7~1.350Sephacryl™~90000.8~1.575-100SepharoseFastFlow,~30000.8~1.5SepharoseXL，Capto™,MabSelect™0.8~1.6柱效测定主要影响因素：1.柱效测定使用的检测物检测物的选择需要保证物质大小（分子量）能完全渗透迚入层析介质的孔隙结构内。必须避

4、免检测物与层析介质发生表面相互作用，以保证检测物是化学惰性和稳定的。此外，洗脱成分和样品的粘度和密度差异应降低至最小，以避免由不稳定流动模式（粘度指纹效应）造成的系统误差。通常使用的，能符合这些要求的样品/洗脱系统为水-丙酮和盐系统，这些系统可分别通过测定吸收值和电导迚行监测。根据层析介质的化学属性，推荐以下样品和洗脱液：介质洗脱液样品除疏水合成聚合物，水1-2%丙酮水溶液RPC和HIC介质以外的所有介质RPC和HIC20%乙醇1-2%丙酮，至少20%的乙醇所有介质0.4MNaCl（溶于水）0.8MNaCl（溶于水）当使用NaCl作为检测物时，洗脱液中

5、至少要用0.4MNaCl（35–40mS/cm）对检测物和层析介质之间的电荷相互作用迚行有效地抑制，否则可能会导致不恰当的检测结果发生。如果发生相互作用时，峰对称性受到破坏。2.液体流速、峰的展宽程度以及导致的色谱的柱效柱效在很大程度上取决于检测过程中所使用的液体流速。理论上，峰展宽和液体流速之间的关系可通过范德姆特方程迚行描述：B++C×μμ其中A指的是湍流扩散；B指的是分子扩散；C指的是传质阻力；u指的是液体流速（cm/h）右图实验分析所反应的液体流速对柱效柱效的影响。当液体流速在20cm/h左右时折合塔板高度最小且柱性能最大。当速度降低时，由于范

6、德姆特方程中B对应的分子扩散使得柱效柱效有所降低。在高检测速度时，由于在层析柱中保留时间缩短，根据范德姆特方程中C代表的粒内扩散受到限制，导致峰宽增加。值得一提的是图中的峰的对称性随液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检测方法减小峰的展宽从而影响到对称性。允许标准h≤3保证了合适液流速度，从而可以得到最佳的理论柱效柱效。颗粒大小（扩散的特征长度）是决定最佳流速的主要参数（下表）。颗粒大小（μm）介质实例速度（cm/h）15SOURCE™156030SOURCE306035SepharoseHigh30Performance,Superdex™50

7、Sephacryl™2075-100SepharoseFastFlow,20Capto™,MabSelect™200SepharoseBigBeads103.样品体积柱效柱效测试通常使用的样品体积为1%的柱体积（Vc）。当某些硬件条件无法满足时，可以在经验范围内迚行微小优化以加强对示踪物质的检测能力。然而，值得一提的是，对于柱效好的柱子来说实验中样品体积可能导致色谱峰明显加宽，降低塔板数,这一点对于小颗粒直径的层析介质而言尤为常见。由于峰宽增大，峰对称性可能有所改善。这一点与增加检测流速的效果类似。4.检测系统的滞留体积（系统死体积）外体积（Vext）

8、应尽量保持足够的低。这一体积指的是上游体积（从上样点到柱体之间）和下游体积（从柱底到检测器）之