蛋白质分离纯化技术实验讲义

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1、实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBBG-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。

2、蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、TritonX-100、SDS和0.1N的NaOH。三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。2、器材：滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100mg考马斯亮蓝G-250，溶

3、于47.5ml无水乙醇后，再加入100ml85%的磷酸，加MiliQ水定容至1L，过滤备用。2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的编号为8、9、10号管。3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。4、标准曲线制作以标准蛋白的量（mg

4、）为横坐标，吸光值OD595为纵坐标作图，即得一条标准曲线。由此标准曲线，求得趋势线以及公式（y=ax+b，其中y为吸光度值OD595，x为蛋白质的量，a和b为常量）并给出R2值，R2值越接近1证明曲线越接近实际结果，根据此公式及未知样品的吸光度值，计算每管中加入的未知蛋白的量，进而推算其浓度。5、本实验采用的未知样品为麦曲中糖化酶分离纯化实验所得的粗酶液样品。一、实验结果记录OD595记录表管号12345678910标准蛋白质（ml）00.010.020.040.060.080.10MiliQ（ml）0.10.090.080.060.040.020考

5、马斯亮蓝G-250溶液（ml）5555555555每管中蛋白质的量（mg）00.010.020.040.060.080.10光吸收值（OD595）未知蛋白浓度（mg/ml）标准曲线图标准曲线：R2值：实验二、糖化酶酶活测定一、实验目的1、了解糖化酶酶活力单位的定义、测定原理；2、掌握糖化酶酶活测定的方法。二、实验原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。1g固体酶粉（或1ml液体酶），于4

6、0℃，pH=4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/g或U/ml表示。三、试剂与器材1、试剂乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05M，pH=4.6);0.05M硫代硫酸钠标准溶液；0.1M碘溶液；200g/LNaOH溶液；0.1MNaOH溶液；2M硫酸溶液；20g/L可溶性淀粉溶液（现配）。2、器材恒温水浴锅；秒表；比色管；碘量瓶，滴定管。四、实验方法1、糖化酶反应阶段：于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入25ml可溶性淀粉溶液（20g/L）及5ml乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05M，pH=4.6)，摇匀后于40℃水浴锅中预热

7、5min。在甲管中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下反应30min，两管中立即加入200g/L氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，终止反应，迅速取出冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml。2、碘量法测定葡萄糖含量阶段：吸取上述反应液与空白液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1M碘溶液10ml，再加入0.1M氢氧化钠溶液15ml，边加边摇匀，密塞，于暗处静置反应15min，取出，加2M硫酸溶液2ml。1、滴定阶段：上述反应液立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失呈无色，即为其终点。注：不同稀释倍数，应做相应的空白试验。2、酶活力计算40

8、℃、pH4.6下，1小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。X=（A-B）