蛋白质分离纯化技术实验讲义

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1、实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBBG-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸

2、收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、TritonX-100、SDS和0.1N的NaOH。三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。2、器材：滤纸；烧杯

3、；漏斗；可见分光光度计；试管。四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5ml无水乙醇后，再加入100ml85%的磷酸，加MiliQ水定容至1L，过滤备用。2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的编号为8、9、10号管。3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。注意：

4、不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。4、标准曲线制作以标准蛋白的量（mg）为横坐标，吸光值OD595为纵坐标作图，即得一条标准曲线。由此标准曲线，求得趋势线以及公式（y=ax+b，其中y为吸光度值OD595，x为蛋白质的量，a和b为常量）并给出R2值，R2值越接近1证明曲线越接近实际结果，根据此公式及未知样品的吸光度值，计算每管中加入的未知蛋白的量，进而推算其浓度。5、本实验采用的未知样品为麦曲中糖化酶

5、分离纯化实验所得的粗酶液样品。一、实验结果记录OD595记录表管号12345678910标准蛋白质（ml）00.010.020.040.060.080.10MiliQ（ml）0.10.090.080.060.040.020考马斯亮蓝G-250溶液（ml）5555555555每管中蛋白质的量（mg）00.010.020.040.060.080.10光吸收值（OD595）未知蛋白浓度（mg/ml）标准曲线图标准曲线：R2值：实验二、糖化酶酶活测定一、实验目的1、了解糖化酶酶活力单位的定义、测定原理；2

6、、掌握糖化酶酶活测定的方法。二、实验原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃，pH=4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/g或U/ml表示。三、试剂与器材1、试剂乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05M，pH=4.6);0.05M硫代硫酸钠标准溶液；0.1M碘溶液

7、；200g/LNaOH溶液；0.1MNaOH溶液；2M硫酸溶液；20g/L可溶性淀粉溶液（现配）。2、器材恒温水浴锅；秒表；比色管；碘量瓶，滴定管。四、实验方法1、糖化酶反应阶段：于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入25ml可溶性淀粉溶液（20g/L）及5ml乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05M，pH=4.6)，摇匀后于40℃水浴锅中预热5min。在甲管中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下反应30min，两管中立即加入200g/L氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，终止反应，迅速取出冷却，并于乙管（空

8、白）中补加待测酶液2ml。2、碘量法测定葡萄糖含量阶段：吸取上述反应液与空白液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1M碘溶液10ml，再加入0.1M氢氧化钠溶液15ml，边加边摇匀，密塞，于暗处静置反应15min，取出，加2M硫酸溶液2ml。1、滴定阶段：上述反应液立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失呈无色，即为其终点。注：不同稀释倍数，应做相应的空白试验。2、酶活力计算40℃、pH4.6下，1小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。X=（A-B）