用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白开题报告

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1、开题报告用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白1选题的背景和意义全球每年有近一百万人受到HCV感染，我国属HCV高感染区，人群的丙型肝炎患病率约为2.1%，HCV可持续感染患者长达30年之久，其中有些患者最终可发展成为肝硬化及肝细胞癌，严重危害人民的生命健康，目前对HCV既无有效的治疗药物，也无预防性的疫苗。杆状病毒是一类双链DNA病毒，其DNA是9.0xl04-2.3x105bp的环状分子AcNPV和BmNPV的DNA分子为1.35X105bP左右，病毒粒子呈杆状，其感染宿主细用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白胞后能够产生两种类型的病毒，一种是包涵型

2、病毒(OV)，又称多角体获得病毒(PDV),另一种是芽生型病毒(BV)，或称胞外病毒(ECV)。在感染的细胞核中，一部分核衣壳外形成囊膜，多角体或颗粒体蛋白沉积于囊膜上，形成包涵体病毒。另一部分核衣壳通过出芽的方式从细胞质膜获得囊膜，形成芽生型病毒。包涵体衍生的病毒主要进行昆虫之间的感染传播，而芽生型病毒则负责昆虫体内感染的扩散。包涵型病毒和芽生型病毒在基因组层次上完全一致，但由于囊膜获得方式的不同，其分子组成略有差别，主要是囊膜糖蛋白不同，芽生型病毒的糖蛋白为gP64，而包涵型病毒是gP41，由于糖蛋白在病毒识别受体和侵染细胞中起重要作用，因此包涵型病毒

3、和芽生型病毒对不同组织细胞有不同感染力:包涵型病毒对肠中细胞感染力强，适于对昆虫进行喂食感染，而芽生型病毒对体腔中细胞感染力强，感染虫体时须经体腔注射。用杆状病毒系统表达丙型肝炎病毒结构蛋白将为进一步研制适用于人的HCV预防性疫苗打下工作基础。2相关研究的最新成果及动态2.1该项研究的发展历程杆状病毒发展成一种哺乳动物基因转移载体昆虫杆状病毒表达载体系统的研究始于上世纪80年代，是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统后建立起来的又一高效表达系统。目前用作表达载体的杆状病毒均为核型多角体病毒，以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒为代表。

4、由于其宿主特异性，一般认为该种高表达载体仅限于介导外源基因在昆虫细胞内表达，在非受纳细胞中不能发挥作用。然而1983年，Volkman等。发现AcNPV能够侵入一些脊椎动物细胞系中，同年和次年，Groener和TjiaH等也分别发表文章报道AcNPV可以侵入哺乳动物细胞。此外，在上述三例报道中均未检测到子代病毒产生，亦无病毒基因组复制表达。以上研究结果表明杆状病毒可以侵入哺乳动物细胞，但是其病毒基因组在哺乳动物细胞中不能复制和转录。这些研究为将杆状病毒发展成为介导外源基因进入哺乳动物细胞表达的新型基因转移载体提供了理论依据。2.2在昆虫细胞中装配形成的HC

5、V-VLP5HCV为单正链RNA病毒，基因组RNA长约9.5kb，仅有一个开放读码框架(ORF)，编码一约3011个氨基酸的多聚蛋白前体，该前体蛋自在宿主信号肽酶及病毒蛋白酶作用下，裂解为病毒的结构蛋白与非结构蛋白。HCV结构蛋白包括核，c、蛋白(C)、包膜蛋白-1(E1)和包膜蛋白-2(E2)。核心蛋白和HCV基因组RNA构成核衣壳，在其外面再围上包膜蛋白就组成了完整的HCV病毒体(Virion)。人们一直试图从组织中培养HCV，Bautenschlager把截短的HCV基因组插入人的细胞，用组织培养，虽表达出HCV蛋白，但没有病毒的复制。Rice等人增

6、加所插入基因片段长度，还有学者用HCV的全氏cDNA插入人细胞，发现尽管完整的HCV基因组能在组织培养中有效复制，但所产生的各种蛋白不能形成病毒粒子，可能是细胞培养中缺少某些能让表达的各个HCV蛋白正确地包装出完整病毒的细胞因子。病毒的分离至今未成功，也未找到合适的体外细胞培养系统。丙型肝炎病毒样颗粒(HepatitisCvirus—likeparticles，HCV—VLP)与天然的HCV病毒体不同，它是不含HCV基因组、本身不复制而能较好地保留HCV抗原性的类病毒颗粒。2.3细胞内HCV病毒颗粒检测的研究动态有许多学者尝试建立HCV感染细胞模型，并在细

7、胞内检测病毒颗粒。如Shimizu等采用对HCV易感的淋巴细胞系进行体外培养，在接种后4天-24天收集细胞，用RT-PCR检测负链HCVRNA(即病毒复制中间体)，并以抗-HCV核心区和抗包膜糖蛋白单克隆抗体作免疫荧光(IF)检测，同时作常规电镜(EM)和酶标记免疫电镜(IEM)检测。另外，他们还接种了10只黑猩猩，并于感染后5周内开腹取肝组织用IF和EM检查。结果表明，培养后6天可一次性地检出细胞内负链HCVRNA，即复制中间体，而正链HCVRNA则在3周内均能测出。培养12天后，用IF检出细胞质内有核心蛋白和包膜蛋白，第15天阳性细胞达20％。阳性颗粒

8、呈颗粒状，位于细胞核周围，细胞质小泡内有50nm直径的病毒样颗粒，