DB37-鸭细小病毒感染诊断技术第1部分：病毒分离鉴定

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1、ICS65.020.30B41DB37山东省地方标准DB37/XXXXX—XXXX鸭细小病毒感染诊断技术第1部分：病毒分离鉴定DiagnostictechniquesforduckparvovirusinfectionPart1:IsolationandidentificationofduckparvovirusXXXX-XX-XX实施XXXX-XX-XX发布山东省质量技术监督局本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、杨晶。鸭细小病毒感染诊断技

2、术第1部分：病毒分离鉴定1范围本标准规定了鸭细小病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。本标准所规定的鸭细小病毒分离鉴定和PCR检测方法适用于鸭组织、分泌物、排泄物和病毒培养物中鸭细小病毒分离鉴定及其核酸检测。PCR方法还适用丁-该病的的实验室诊断、监测和流行病学调查等。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义

3、下列定义和术语适用于本文件。3.1鸭细小病毒Duckparvovirus也称新型鹅细小病毒，是引起鸭短喙侏儒综合征的病原，该病以生长障碍，短喙、舌外露为特征。3.2间接免疫荧光试验IndirectimmunofIuorescenceassay（IFA）用对应某一种抗原的抗体（这里被称为一抗）与细胞孵育结合，在采用对应一抗（也就是抗一抗）的抗体（这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子）与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光信号为阳性反应。3.3原代鸭胚肝细胞DuckembryoIiverceII（DEL）采用胰酶消化法，用15日龄~20H龄SPF鸭胚肝脏制备的原代细胞。4实验室质

4、量控制4.1实验室符合GB19489和GB/T27401要求，实验室必须为生物安全I【级（BSL-2级）及以上实验室。4.2从事PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分岀前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。病毒分离区域的鸡胚接种操作区和细胞培养操作区也应遵循一定的布局原则，避免交叉污染。4.3注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过适当的方式（如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理。4.4生物样品

5、应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做最终处理。4.5人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。4.5.1仪器设备a）生物安全柜；b）PCR仪；c）CO?恒温培养箱（37°C恒温）；d）台式低温高速离心机（最大转速12000r/min）；e）电泳仪；f）电泳槽；g）紫外凝胶成像仪；h）2°C〜8。C冰箱；i）-20°C冰柜：j）微量移液器（最大量程分别为10口八20u1八100U1八1000uL）,带滤芯的枪头；k）孵化器

6、（37°C恒温）；l）水平摇床；m）电子天平精度为：0.001g；n）电磁炉或微波炉。4.5.2试剂和材料a）DNA提取试剂盒；b）rTaqDNA聚合酶（5U/uL）；c）10XPCRBuffer；d）dNTPs（2.5mmol/L）；e）1.5%琼脂糖凝胶,见A.1；f）1XTAE缓冲液,见A.2；g）漠化乙锭（10ng/nL）,见A.3；h）核酸电泳加样缓冲液，见A.4；i）DNA分子量标准，要求在100bp〜2000bp之间，有5条以上的指示条带；j）已知的鸭细小病毒液阳性对照标准品；k）健康鸭组织或细胞作为阴性对照标准品；l）固定液，甲醇：丙酮二1:1（V/V）；m）FITC标记

7、的鼠抗兔荧光抗体；n)细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM培养基)；o)兔抗鸭细小病毒多克隆抗体；P)细胞维持液(含1%胎牛血清的DMEM培养基)；q)SPF鸭胚；r)PCR检测引物：上游引物5455F：5'-GAGCATCAACTCCCGTATGTCC-3'；下游引物5371R：5'-CTACTTCCTGCTCGTCCGTGA-3'；扩增目的片段长度为661bp；引物浓度均为50umol/Lo5样品的采集和处理5.1样品的采集采