假微型海链藻DGAT基因cDNA全长序列的分子克隆和分析【开题报告】

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1、毕业论文开题报告海洋生物资源与环境假微型海链藻DGAT基因cDNA全长序列的分子克隆和分析一、选题的背景与意义1.微藻制备生物柴油1.1生物柴油近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注逐渐成为热点。生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的单烷基脂肪酸酯。生物柴油作为化石燃料的替代品，与化石柴油和燃料乙醇等其他液体燃料相比，有着突出的特性：生物柴油不含石蜡，闪点高，燃烧性能和效率要高于普通柴油，使用时更安全；可以通过种植、养殖或培养源源不断地得到

2、，因而属于可再生资源；生物柴油产品中含硫和氮较少，可以减少产生SO2和NO对大气的排放量。以淀粉类作物和木质纤维素类物质发酵产生的燃料乙醇，燃烧后尾气排放污染小，但其热值只有普通汽油的2/3，比柴油更低，且乙醇易吸水使燃烧值下降。1.2微藻制备生物柴油的优势作为新一代生物柴油原料，微藻拥有很多优势。例如：微藻种类繁多，分布极其广泛。全球已经鉴定的微藻大约有40000种，且其数量还在不断增加。大多分布在江海湖泊中，不与农作物争地，可以整年生长。微藻通常呈单细胞或丝状体，结构简单，整个生物体都能进行光合作用，所以光合作用效率高，生长周期短、速度快。微藻还可利用微生物发

3、酵技术，在光反应器中高密度、高速率培养。在同样条件下，微藻细胞生长加倍时间通常在24h内，对数生长期内细胞物质加倍时间缩短至3.5h。微藻油脂含量高。例如葡萄藻（Botryococcusbraunii）的含油量为细胞干重的25～75%。而高等植物种子的脂肪酸含量仅为干重的15%~20%左右。其油脂组成与一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸为主。微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量CO2和氮化物或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。1.3假微型海链藻假微型海链藻属于中心硅藻纲，圆筛藻目，海链藻属。通过尼罗红染色法对宁波大学微藻种质库的63株微藻进行筛选，

4、研究结果显示，中性脂含量最高的为假微型海链藻（T.pseudonana），虽然假微型海链藻的中性脂含量最高，但是其细胞密度在整个生长期都比较低，因此对它的分子研究及培养条件的优化极为重要。1.3.1DGATDGAT(二酰甘油酰基转移酶)催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是该途径的限速酶，对它的研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。另外，DGAT基因全长的克隆为下一步转入到拟南芥中提供目的基因。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：1.研究的基本内容1.1假微型海链藻（T.pseudonana）DGAT基因全长cDNA

5、的克隆1.2DGAT基因全长cDNA序列分析、比对2.拟解决的主要问题2.1得到假微型海链藻DGAT基因全长cDNA的克隆2.2分析和比对DGAT基因全长cDNA序列三、研究的方法与技术路线：1.假微型海链藻（T.pseudonana）DGAT基因全长cDNA的克隆1.1材料实验材料假微型海链藻（T.pseudonana）取自宁波大学微藻种质库，于5000mL三角瓶中，在温度20℃，盐度25～30‰，光照强度为50μmol/(m2·s)，光暗比12h:12h的条件下采用NML3#培养液（表1）培养10d。表1.NML3#培养液配方Table.1.Compositi

6、onofculturefluid营养成分含量（g/L）KNO3100KH2PO410EDTA-Na220C6H5O7Fe.5H2O1MnSO40.5VB16×10-3VB125×10-5Na2SiO321.2方法1.2.1总RNA的提取首先，将三角瓶中的假微型海链藻（T.pseudonana）离心，去上清，得到100mg的藻泥于2mlEP管中。然后加入1mL的Trizol试剂，超声波清洗机中超声5min后提取总RNA。最后用20μLDEPC水（RNaseFree）溶解RNA，测定RNA的浓度和OD260/OD280的值。1.2.2反转录合成cDNA的第一条链取各样

7、品RNA1μg按TakaraPrimeScriptTMRT-PCRKit（宝生物工程有限公司）操作方法：在一个DEPC水处理过的PCR管中加入总RNA1μg，OligodTPrimer(2.5μM)1μL，dNTPMixture（10mMeach）1μL，加RNaseFreedH2O补至10μL，PCR仪上65℃反应5min后，离心数秒使模板RNA、引物等的混合液聚集于PCR管底部。然后加入5×PrimeScriptTMBuffer10μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，PrimeScriptTMRTase（for2step）0.5μL，

8、RNase