产前诊断中的基因检测

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1、产前诊断中的基因检测四川省妇幼保健院生殖中心；四川省计划生育科研所遗传室　李运星　以简炼的方式介绍产前诊断基因水平诊断的技术方法，并加以常见的病例给予说明，值得基层的产前诊断与优生优育工作者一阅。　　基因检测在产前诊断中是十分重要，且正在不断发展与完善，其实质是在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。基因诊断始于1978年，美国科学家首先将限制性片段长度多态性（RFLP）用于基因诊断，从而揭开了基因诊断的序幕，基因诊断不仅可以明确指定个体是否患病，存在基因缺陷并揭示基因

2、状态，而且可以对表型正常的携带者、对某种疾病的易感者作出诊断和预测。分子遗传检测技术大致可分为酶谱分析法、聚合酶链反应（PCR）、探针杂交分析法、DNA测序等方法。实际上，临床上多将这几种技术联合应用于基因检测。9一、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）　　人群中不同个体基因的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶切产生的片段长度和数量发生变化称为RFLP。任何一个基因内

3、切大片段的缺失、插入以及基因重排，即使不影响到限制性内切酶位点的丢失或获得，也很可能引起限制性内切酶图谱的变化，使限制性内切酶片段的大小和数量发生变化，因而这类基因突变可以通过限制性内切酶DNA或结合基因探针的杂交方法将突变找出。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　例如　　1.镰形红细胞贫血症的基因诊断：　　　　　　　　　　　　　9　　已知镰形红细胞贫血症的突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，可用限制性内切酶MstⅡ进行检测。因为这一突变使正常存在的MstⅡ切点消失，这

4、就使正常情况下存在的1.1kb及0.2kb条带变成患者（纯合子）的1.3kb条带。　2.血友病A的诊断　血友病A是一种X连锁隐性遗传病。用VⅢ因子基因的cDNA片段作为探针对待检者DNA酶切片段进行杂交，就可检出VⅢ因子基因部分缺失的男性患者和女性携带者。下图　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　9　　　　　家系Ⅲ-1患有严重的血友病A，经VⅢ因子治疗后产生VⅢ因子抑制物。用两种不同的内切酶和探针组合对家系成员作RFLP分析。应用BclI/探针B（VⅢ因子基因）VⅢ因子基因部分缺失所致血友病A的基

5、因诊断　　探针A是VⅢ因子基因1.7kbKpnIcDNA片段，包括1～12外显子。　　探针B是VⅢ因子基因4.7kbEcoRIcDNA片段，包括14～25和部分26外显子。A、B、C、D代表X染色体。　　患者无Bcl/探针1.2和4.4bk,但有SstI/探针A14.5kb、4.7kbEcoRIcDNA片段，包括14～25和部分26外显子，患者不见1.2kb和4.4kb。应用SstI/探针A（因子基因1.7kbKpnIcDNA片段，包括1～12外显子），患者和他的母亲（必然杂合子）出现异常的14.5

6、kb。这一实验结果表明，VⅢ因子基因3’端部分缺失后，其5’端残留部分可由SstI/探针A检出。杂合子兼有BclI/探针B检出的1.2kb和4.4kb与SstI/探针检出的14.5kb。二、PCR技术在遗传病基因诊断中的应用特点　　1983年KaryMullis发明了PCR技术。这项生命科学发展史上具划时代意义的技术一出现，首先就被分子遗传学家应用于几种常见的人类单基因遗传病的基因诊断、携带者检查和产前诊断，例如镰形红细胞贫血病（SicleCellAnemia）、地中海贫血（Thalassemia）

7、、DMD/BMD（进行性肌营养不良）、血友病（Hemophilia）等等。我国1987年启动的国家高技术发展计划（863），对遗传病的基因诊断及相关新技术的研究结予了支持，及时拥有国际先进技术，完成了多项重要研究课题，获得了一大批科研成果。当时已完成了十多种遗传病的三十多例高危胎儿的产前基因诊断。　　视频：PCR原理(让我们用动画了解)9　　PCR技术被称为试管里的基因克隆术，靶基因片段以2n的指数形式迅速增加（n代表循环数）。30个热循环后，靶DNA拷贝数就扩增上百万倍之多！而这仅仅需要约2～3个

8、小时。PCR反应结束后，运用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯胶电泳（PAGE,polyacrylamidegelelectrophoresis）进行PCR产物的分离分析，经溴乙啶（EB）染色或银染，即能观察到特定长度的DNA区带图谱。根据图谱即可作出基因诊断，也可对PCR产物进一步酶切，克隆或直接测序。值得指出的是，PCR并不仅仅是一个简单的DNA扩增反应，而是一项可以作出千变万化的改造，从而衍生出许许多多反应，运用于各种不同的研究和基因检测之中。　　我国β地中海贫血是由于位于