重组DNA及人类基因组研究.ppt

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1、重组DNA技术及人类基因组研究基因工程诞生的历史背景：1973年是基因工程诞生的元年。1.1944年OswaldT.Avery等的肺炎球菌转化证明了DNA是遗传信息携带者。2.1953年JamesWatson和FrancisCrick两人提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。3.1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。4.1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为cDNA的制备奠定了基础。5.染色体外DNA----质粒

2、的深入研究，为第一批重组DNA载体提供了材料。6.1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化，为DNA的体外重组提供了有力的工具。7.1972年，Berg.D等人首次用限制性内切酶EcoRI切割噬菌体和SV40病毒DNA分子，将这两种不同来源的DNA片段成功地在体外连接成杂合DNA分子。至此，用重组DNA技术改变生物学性状的尝试在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技术为生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本身也迅速地发展起来，并广泛地渗透到各个学科的研究领域。(一)DNA克隆克隆（clone）:来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合

3、。获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,即无性繁殖。技术水平：分子克隆（molecularclone）：即DNA克隆细胞克隆：个体克隆（动物或植物）一、重组DNA技术相关概念DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA连接成具有自我复制能力的DAN分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称为基因克隆或重组DNA基因工程（geneticengineering）：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称为基因工程，又称重组DNA工艺学目的a分离获得感兴趣的

4、基因或DNAb获得感兴趣的基因表达产物（二）重组DNA技术中常用的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶分类：I,II,III类基因工程常用II类作用:与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA命名方式限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；产生的切口可以是

5、粘性末端、平头或钝性末端、配伍末端。。５’５’３’３’II类酶识别序列特点５’３’５’３’５’３’５’３’５’３’同功异源酶来源不同的限制酶,能识别和切割同一位点,这些酶称为同功异源酶.同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后会产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端成为配伍末端（compatibleend)(三)目的基因目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(targetDNA)。类型：cDNA(complementaryDNA)：指

6、经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。基因组DNA(geneticDNA)：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。（四）基因载体为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子载体选择标准可转移性合适的复制位点多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源DNA常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体成为克隆载体。表达载体（expressionve

7、ctor)：为使插入的外源DNA序列可以转录翻译成多肽链而特意设计的载体成为表达载体。质粒能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状二重组DNA技术基本原理以质粒为载体的DNA克隆（一）目的基因的获取化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列基因组DNA库（genomicDNAlibrary）cDNA文库(cDNAlibrary)PCR反应化学合成法获得目的基因从基因组文库获取目的基因存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因DNA的集合从cDNA文库获取目的基因（二）克隆载体的选择和构建载体容量合

8、适的克隆位点载体的稳定性(三）外源基因与载体的连接粘性末端连接：同一限制内切酶酶切点连接不同限制内切酶酶切点连接配伍末端和非配伍末端同一内切酶酶切位点连接配伍末端的