受试菌初步鉴定

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1、受试菌初步鉴定摘要:从第一次环境微生物分离的实验中选収菌落,经平板划线得到纯培养后，进行革兰氏染色、鞭毛染色及-•系列生理生化实验得到该菌基本特征，最后经过16SrRNA基因PCR测序进行网上比对并查询伯杰氏手册初步鉴定为藤黄微球菌。关键词：革兰氏染色16SrRNA测序藤黄微球菌前言环境中的微生物混杂存在，要对微生物进行研究利用，需从环境中分离出菌种得到纯培养，并进行初步鉴定。因此，对微牛物进行初步鉴定在微牛物的研究屮至关重耍。初步鉴定可按以下方法进行：分离出受试菌后在平板上观察菌落形态，经革兰氏染色、鞭毛染色和一系列生理生化实验得到其

2、某本性质,通过16SrRNA基因PCR测序比对并结合相关特性得到初步鉴定结果。目的和意义1、学习微主物分类鉴定的基本原理。2、掌握鉴定的基木操作和流程。3、了解多项分类学的意义。材料与方法一、材料与用品1、菌种：受试菌2、培养基：牛肉膏蛋白腺固体培养基，固体淀粉培养基，匍萄糖发酵半固体培养基，乳糖发酵半固体培养基。3、试剂：草酸钱结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液、硝酸银染液A/B液、蒸馅水、氨节青霉素溶液。二、实验步骤1、革兰氏染色（以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别为阴性和阳性对照）（1）制片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片

3、、干燥和固定。（2）初染：滴加草酸钱结品紫染液覆盖涂菌部位，染色1〜2min后倾去染液，水洗至流出水无色。（3）媒染：先川卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖lmin,倾去碘液，水洗至流出水无色。（4）脱色：将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色，当流出液无色时立即用水洗去乙醉。（5）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去用番红复染液染色加in,水洗，吸去残水晾干。（6）镜检：油镜观察。2、鞭毛染色（硝酸银染色法）（1）制片：取适量受试菌制成菌悬液，取一滴菌悬液滴到洁净载玻片一•端，倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端，

4、用吸水纸吸去多余菌悬液，口然干燥。（2）染色：滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3〜5min后用蒸馅水充分洗去A液。用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面约lmin,其间叮用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸镉水冲洗，自然干燥。（3）镜检：用汕镜镜检观察。3、淀粉水解实验（1）将固体淀粉培养基熔化后冷却至50°C左右，无菌操作制成平板。（2）用接种坏挑取受试菌在平板上进行划线接种。（3）将平板倒置在37°C恒温箱中培养24h。（4）观察细菌牛长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板

5、。观察菌落周围是否有透明水解圈。4、糖发酵实验（1）取装冇葡萄糖发酵半固体培养基和乳糖发酵半固体培养基的试竹各一支。（2）用接种环取受试菌进行半固体穿刺，做好标记后置于适宜条件下培养一段时间。（3）观察培养基颜色是否变化（产酸），半固体是否裂开（产气）。5、抗生素抗性实验（1）将牛肉膏蛋白腺琼脂培养基熔化后倒平板。（2）无菌操作，用蹑子取无菌滤纸条进入氨节青霉素溶液润湿，在容器内壁沥去多余溶液,再将滤纸条贴在平板上。（3）无菌操作，用接种环取受试菌，从滤纸条边缘垂宜向外划线接种。（4）将上述平板倒置于37°C保温24h,观察细菌生长状况

6、并记录。6、16SrRNA基因PCR（1）取ImL菌液于1.5mL微量离心管中,12000rpm离心lmin；弃上清,用移液器吸去残液,加入50uL无菌水，重悬细胞。（2）放入沸水中煮10-15mino（3）12000rpm离心2min。（4）取上清2uL当模板。（5）将2nL±清加入PCR管屮，与预混的体系（Tag酶，dNTP,引物，缓冲液，水）。（6）扩增条件：预变性：94°C,lOmino每一个循环包括:变性：94°C,60s；复性：55°C,60s；延伸：72°C,60s；循环次数：32次。最后72°C保温lOmin。（7）取5

7、nLPCR产物琼脂糖电泳检测结果。（8）如果条带清晰则送出测序。结果与讨论—、结果1、分离环境：手指表面。2、形态特征（1）菌落特征：菌落呈黄色，圆形、突起、全缘，湿润有光泽，粘稠易挑起，菌落正反面颜色相同。（2）显微特征：球状，菌体略大于金黄色葡萄球菌，常为八叠、四叠，也冇成双及其他不规则分布形态，不运动。革兰氏染色阳性，无鞭毛。3、理化特性（1）淀粉水解实验：阴性。不产胞外淀粉酶。（2）糖发酵实验：葡萄糖发酵：不产酸不产气乳糖发酵：不产酸不产气（3）抗生素抗性实验：对氨节青霉素敏感，无抗性。4、16SrRNA基因PCR结果及网上比对

8、结果（1）PCR结果：TCGACGGCTCCCCCCACAAGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCGTGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG