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1、精子冷冻论文设计实验内容：一.常温状态下鲜精活力检测二•精子超低温冷冻保存最佳条件的筛选三•扫描电镜和透射电镜观察冷冻前后精子超微结构的变化，包括：精了•质膜破损，核膜消失，染色质解体，线粒体皤消失，轴丝断裂等四•单细胞电泳观察超低温冷冻精子前后染色体的断裂情况%1.利用低渗肿胀实验检测精子质膜的完整性%1.如來有条件继续做受精孵化实验实验具体过程：%1.新鲜精子活力检测A.器材1•显微镜，细胞计数板，吸管2.海水B.操作步骤1.采集新鲜精液，取部分用海水激活，用显微镜观察精子活力。2.统计精子浓度。（己完成）%1.精子超低温冷冻保存最佳条件的筛选A.器材1.显微镜，细胞计
2、数板，吸管，冷冻管2.海水，各种基础液和抗冻剂，各种激活剂B.操作步骤1•最佳基础液的筛选釆用7种不同的基础液（Ringer'sHBSSBSMISMPRSMMMTS-19MD-20）,抗冻剂使用乙二醇，各基础液与抗冻剂比例为9：1组成稀释液，稀释液与加入鲜精的比例为50：lo（己完成）2.最佳抗冻剂的筛选基础液选用Ringed,稀释液与鲜精比例为50：lo（□完成）抗冻剂浓度浓度浓度浓度浓度DMSO5%10%20%30%40%甘油5%10%20%30%40%乙二醇6%9%12%15%丙二醇6%9%12%15%葡萄糖4%6%8%12%16%3.稀释比例筛选基础液Ringel'
3、s,抗冻剂为乙二醇，两者比例为9：1,精液与稀释液的比例分别设为：1：10I：301：50I：701：100五个不同浓度。（已完成）4.最佳渗透压筛选选葡萄糖做基础液，抗冻剂为乙二醇，稀释液与精液比例为50：1,葡萄糖渗透压梯度设为171.3,214.0,356.6,499.2,641.8（mOsmol/kg）0（已完成）5.最佳激活剂筛选选用基础液Ringer,抗冻剂乙二醇，两者比例为9：1,精液与稀释液的比例1：50,釆用不同激活剂（NaCl（精了最高活力时的渗透压）、葡萄舲少量hCl（精了最高活力时的渗透压）、蔗脚•少量NaCl（精子最高活力时的渗透压）、海水、0.
4、12MNaIIC03+海水）激活，得最佳激活剂。6.冷冻速率与平衡时间的筛选A.直接冷冻。B.二步冷冻法（平衡时间5min,lOmin,20min）oC.三步冷冻法（平衡时间omin,lOmin,20min）o三•扫描电镜和透射电镜观察冷冻前后精子超微结构的变化实验实验内容1.新鲜精子形态观察。2.与新鲜精液对比各种抗冻剂对冷冻后精子显微结构（精子质膜破损，核膜消火，染色质解体，线粒体皤消火，轴丝断裂等）的毒害作用。3.与新鲜精液对比各种基础液対冷冻后精了显微结构（精了质膜破损，核膜消失，染色质解体，线粒体晡消失，轴丝断裂等）的毒害作用。4.统计电子显微镜检精子超微结构冷冻
5、后的变化与精了•活力的相关性A.器材1.菌种大肠杆菌（大肠埃希氏菌,Escherichiacoli）斜面。2.溶液或试剂醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2%磷磚酸钠（pH6.5〜&0）水溶液,（）.3%聚乙烯甲醛（溶于三氯甲烷）溶液，细胞色素c,醋酸馁。3.仪器或其他用具普通光学显微镜，铜网，瓷漏斗，烧杯，平皿，无菌滴管，无菌傲子，大头针，载玻片，细菌计数板，真空镀膜机，临界点干燥仪等。B.操作步骤（一）透射电镜的样品制备及观察1•金属网的处理光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察。而在透射电镜屮，由于电产不能穿透玻璃,只能采用网状材料作为载物，通常称为载网。载网因材
6、料及形状的不同可分为多种不同的规格，其中最常用的是200-4000（孔数）的铜网。网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的淸晰度。可用如下方法进行处理：首先用醋酸戊酯浸漂儿小时，再用蒸懈水冲洗数次，然厉再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水。如來铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）浸1~2分钟，或在l%NaOH溶液中煮沸数分钟，用蒸憾水冲洗数次后，放入无水乙醇中脱水，待用。2.支持膜的制备在进行样品观察时，在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜，否则细小的样品会从载网的孔中漏出去，这层薄膜通常称为支持膜或载膜。支持膜应对电了透明，其
7、厚度一般应低于20nm；在电子束的冲击下，该膜还应有一定的机械强度，能保持结构的稳定，并拥有良好的导热性；此外，支持网在电镜下应无可见的结构，且不与承载的样品发生化学反应，不干扰对样品的观察，其厚度一般为15nm左右。支持膜可用塑料膜（如火棉膜、聚乙烯甲醛膜等），也町以用碳膜或者金屈膜（如彼膜等）。常规丄作条件下，用塑料膜就可以达到要求,而槊料膜中火棉胶膜的制备相对容易，但强度不如聚乙烯甲醛膜。（1）火棉胶棉的制备在一干净容器（烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗）中放入一定量的无菌水，用无菌滴管吸2%火棉胶醋酸戊酯溶液
