胚胎干细胞的制备及研究进展

《胚胎干细胞的制备及研究进展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、胚胎干细胞的制备及研究进展摘要：胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面的研究应用中起着重要的作用。引言近年來，随着科学技术的不断发展，世界各国对胚胎干细胞的研究不断深入,取得了许多突破性的进展⑴。科学证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞

2、、神经胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。ES细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体⑵。这意味着ES细胞将在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面发挥重要作用，为人类攻克癌症等疑难杂症开辟新的道路。1胚胎干细胞胚胎干细胞是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞或附植后胚胎的原始生殖细胞(Pr

3、imordialgermcells,PGCs)通过体外分离培养1何建立的克隆细胞系。它具有与早期胚胎细胞相似的形态，即胞体小、核大、胞浆少且具有正常的二倍体核型。ES细胞最突出的特点是只生长不分化，且保持早期胚胎发育的全能性,在饲养层上或含有白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)的培养基中，可稳定传代，长期培养。休外诱导分化可形成3个胚层的分化细胞。另外，ES细胞还具有种系传递功能和具有培养细胞所有的特征⑶。胚胎干细胞不但可用于研究哺乳动物胚胎早期发冇和细胞谱系分

4、化，述可对它的基因组进行操作,通过基因打靶、突变和转基因等技术，建立各种实验模型，研究发育、肿瘤、免疫以及人类遗传病等有关问题，大大推动和发展了哺乳动物生物学的研究。2胚胎干细胞的分离与制备根据物种的不同，ES细胞所取的时期也不一样，小鼠多选用3〜4d的囊胚或2〜3d的桑甚胚，猪取8〜10d的囊胚，绵羊取8〜9d的囊胚，而人和牛取7〜8d的囊胚。分离制备的方法冇两种：第一种是免疫手术法。如小鼠，去除囊胚透明带后，直接暴露于兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清，再移至新鲜豚鼠血清，滋养层细胞免疫溶解，然后将内细

5、胞团细胞洗涤后，移到铺有胚胎成纤维细胞或STO饲养层细胞和DMEM基本培液的培养板内进一步制备。第二种是常规方法。先把获得的早期胚胎放于培养体系中培养，内细胞团细胞从贴壁的囊胚中长出來，形成清晰的巢状集落后再将其挑选出来进行培养。ES细胞分离克隆后，需进行扩增或继代培养，目前有两类方法：饲养层细胞培养法和无饲养层培养法。2.1有饲养层培养体系采用饲养层细胞培养法需要先准备饲养层细胞以小鼠为例，口前使用的主要有原代小鼠胚胎成纤维细胞(primarymouseembryofibrobiast,PMEF)

6、、各种品系3~5代小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblast,MEF)以及已建系的SIM小鼠胚胎的对硫代鸟卩票吟(thioguanine,T)和乌苯昔(ouabain,0)有抗性的成纤维STO细胞系⑷。这些细胞均需用10mg/L丝裂霉素在37°C处理4h,用前经PBS彻底洗涤。PMEF和MEF对ES细胞的抑制分化和促生长作用优于STO,但其生命期有限，且随着传代次数的增多，其分泌齐种因子的能力下降；PMEF和MEF也不具冇耐药性，不能用丁•转染外源基因的ES细胞的筛选。STO细胞

7、能用于转基因ES细胞的筛选⑹,它主要分泌干细胞生长因子(stemcellfactor,SCF)和白血病抑制因子(LIF)OLIF具有广泛的生物学特性，能促进滋养层细胞增值和内细胞团生长，而SCF能诱导干细胞进入细胞周期，捉高转基因效率，对干细胞有显著的促分裂作用。但一般认为，STO细胞系经长期培养和反复冻存后会使分泌细胞因子的能力下降，总体效果不如PMEF和MEFo2.2无饲养层培养体系采用无饲养层的方法进行培养，首先，可克服使用饲养层细胞培养ES细胞的繁琐；其次，可排除实验屮的细胞接触抑制作用及饲

8、养细胞分泌其它因子的干扰,从而更为准确地研究某一因子对ES细胞生长的影响；第三，能排除处理饲养层细胞时所用丝裂霉素对ES细胞的毒性作用。但用条件培养基作培养液分离和克隆ES细胞，只能在短期传代屮维持ES细胞全能性及核型正常⑸。常用的方法是在培养液中加入外源的LTF和使用能分泌LTF的细胞制备条件培养液等。用转基因的方法，将LIF的基因转入ES细胞中，建立不依赖外源LIF的ES细胞系，也是方法之一。2.2.1LIFLIF是一种口血病抑制因子，也是理想的ES细胞分化抑制剂