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1、胚胎干细胞的鉴定及诱导分化【摘要】胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES细胞)具有两个最显著的特征：一是具有体外高度口我更新的能力；二是它可被定向诱导分化为体内各种类型的细胞。口从20世纪60年代开始研究胚胎干细胞以来，已被广泛用于生命科学的许多领域，其潜在的医学应用成为世界范围内的研究热点。要充分利用ES细胞,必须首先了解ES细胞是如何实现定向分化的。木文概述了ES细胞鉴定方法，并对ES细胞的诱导分化方法及其调节机制进行综述。【关键词】ES细胞，鉴定方法，诱导分化，调节机制1.前言ES细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原
2、始性腺中分离出来的一类干细胞,在休外培养具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性u-21o在一定的培养条件下，ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制，形成基因型相同的细胞群体，实现ES细胞在体外的“永生”。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为内、中、夕卜3个胚层的儿乎所有类型细胞⑶。因此，ES细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具，也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病，修复受损伤的组织和器官的一个重要途径，具有广泛的应用前景⑷。尤其是将基
3、因组学与干细胞生物学结合起来的实践，两者相辅相成，使其在生命科学发展中发挥巨大的推动作用。2.ES细胞的基本概念20世纪60年代，人们发现小鼠畸胎瘤中存在着未分化的多能干细胞，在适当的条件下可形成多种细胞类型。畸胎瘤是原始生殖细胞(primordialgermcell,PGC)癌病而形成的，因此就把这种多能干细胞称为胚胎癌细胞(embryoniccarcinomacell,EC细胞)。EC细胞因具冇发育的多能性而成为研究早期胚胎发育的良好模型，但是EC细胞常常表现出恶性肿瘤的特性。后來，人们发现异位移植的小鼠早期胚胎可自发形成畸胎瘤。
4、这就提示人们若将胚胎在体外进行培养，可从中分离到多能十细胞，同时避免肿瘤的发生。1981年，Evans⑸和Martin161等首次成功地从延缓着床的小鼠胚泡建立了多能干细胞系，这些细胞具冇正常的二倍体核型，并11可分化为多种细胞类型，这种多功能干细胞被称为胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES细胞)。PGC屮存在的多能干细胞，在体外适宜的环境屮可以长期增殖，并保持未分化的状态。在不同信号刺激下，它们可分化为体内多种细胞类型。这种源自PGC的多能性细胞被称为胚胎生殖细胞(embryonicgermcell,EG细胞)
5、7,
6、oEC细胞、ES细胞、EG细胞虽然是3种不同的细胞，但它们都具有在体外无限或较长期增殖和分化的潜能，而且从细胞起源看，它们都宜接或间接地来自胚胎组织，因此可把它们统称为胚胎干细胞。下文将以ES细胞为主，兼顾另外二者，对ES细胞的鉴定方法、诱导分化方法及调节机制进行综述。3.ES细胞的鉴定方法3・1•形态学鉴定ES细胞在形态上的主耍特征是细胞体积小，核人、胞浆少、核质比高，有一个或多突出的核仁，染色质较分散，细胞质内除游离的核糖体外，其他的细胞器很少；ES细胞在体外抑制分化的培养过程中，相差显微镜下细胞堆积、隆起呈集落状生长，集落形态呈
7、鸟巢状，细胞间界限不清，折光性较强凶。不同动物ES细胞大小有差异，小鼠ES细胞的直径为7-18um,猪、牛、羊ES细胞的颜色较深，直径为12〜。3.2.碱性磷酸酶鉴定碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)—种单酯磷酸水解酶，它能在碱性条件下水解磷酸单酯，释放岀磷酸。它是一种膜结合金屈糖蛋白，由两个亚单位组成，具冇多种同工酶。AKP的存在与否是ES细胞保持未分化状态的重要标志。ES细胞中AKP含量丰富，而在分化的细胞屮，含量降低，染色呈弱阳性或阴性⑻。不同动物AKP基因表达情况不同，一些家畜缺乏特异性AKP基因或出
8、现表达丢失，这样利用AKP作为检测标志会给检测带来误导。3.3.胚胎阶段特异表面抗原的检测胚胎阶段特界性表面抗原(Stage-SpecificEmbryonicAntigens,SSEA)是一种在ES细胞表面表达的特异性糖蛋白，其表达量在早期胚胎发育过程屮受到严格的调控。由于不同种系在胚胎发育早期基因的表达调控存在差异，不同种系ES细胞表面标志物也不尽和同，具有种属特异性，例如小鼠ES细胞表达SSEA-1,而不表达SSEA-3或SSEA-4,而人ES细胞恰好相反，表达SSEA-3和SSEA-4,却不表达SSEA-l
9、10
10、o3.2.多
11、能性基因的检测ES细胞均表达Nanog,Sox2,Oct4,Foxd3等一些与多能性和关的基因，通过反转录PCR检测这些多能性基因的表达情况，也是鉴定ES细胞的一种方法。3.3.端粒酶活性分析端粒（Telomere）是真
