氯化钠注射液细菌内毒素分析方法验证执行方案

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1、标题氯化钠注射液细菌内毒素分析方法验证方案/ZL页码1/6一、验证目的确保氯化钠注射液细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。二、适用范围适用于本公司氯化钠注射液的细菌内毒素检测方法。三、职责部门责任人职责质量部方案起草方案审核方案批准检验、出报告四、内容1　实验材料及用具1.1电子天平1.2电热恒温干燥箱1.3试管恒温仪1.4水银温度计1.5旋涡混合器1.6鲎试剂供应商:批号：灵敏度：规格：1.7细菌内毒素国家标准品供应商:中国药品生物制品检定所提供批号：效价：标题氯化钠注射液细菌内

2、毒素分析方法验证方案/ZL页码2/61.8细菌内毒素检查用水供应商:批号：规格：1.9实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。2　实验准备2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用生活饮用水将残留洗液彻底洗净，再用注射用水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中，然后放置入电热恒温干燥箱。2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置电热恒温干燥箱后，将电热恒温干燥箱调至250℃，待电热恒温干燥箱温度升至设

3、定的温度后开始计时，干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源，待电热恒温干燥箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用,否则须再次干烤。3　具体验证步骤3.1鲎试剂灵敏度复核3.1.1目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确，并考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。3.1.2操作方法3.1.2.1细菌内毒素标准溶液的制备将1支细菌内毒素标准品（140EU/支）完全溶解于1ml细菌内毒素检查用水中(置漩涡混合器上混合15分钟)，其浓度为140EU/ml，用这个浓度连续稀释制备1.0EU/ml、0.5EU/m

4、l、0.25EU/ml、0.125EU/ml(每步稀释过程均应在旋涡混合器上混合30秒钟)四个浓度的细菌内毒素标准浓度。3.1.2.2鲎试剂灵敏度复核操作取18支（0.1ml/支）待验证灵敏度的鲎试剂，加入适量的细菌内毒素检查用水，复溶备用。按鲎试剂灵敏度标示值，将16支试管排成4列，每列4支。每个浓度取每列１支(共4支)鲎试剂管，每管加0.1ml，即每一浓度平行做4管。阴性对照管：另取2支鲎试剂管，1支在试验开始时加0.1ml细菌内毒素检查用标题氯化钠注射液细菌内毒素分析方法验证方案/ZL页码3/6水。加样结束后，轻轻振动混

5、匀，避免产生气泡，放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保持60±2分钟后，将试管轻轻取出。避免振动，将每管拿出并缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱为阳性。记录为(-)；未形成凝胶或凝胶不能保持完成并从管壁滑脱为阴性。记录为(+)。3.1.2.3计算：如果最大浓度（1.0EU/ml）均为阳性，最低浓度（0.125EU/ml）均为阴性（阴性对照管均为阴性时试验有效），按下式计算：λｃ=1g-1(∑X/4)式中：X为终点浓度的对数值（lg）。当λｃ在0.25EU/ml～1.0EU/ml(包括0.5λ和2

6、.0λ)时,可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。3.2干扰试验3.2.1目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。3.2.2操作方法3.2.2.1供试品限值中国药典2005年版二部要求，内毒素限值L＝0.5EU/ml。3.2.2.2最大有效稀释倍数（MVD）的确定按下试计算：MVD＝CL/λ＝1.0(ml/ml)×0.5(EU/ml)/0.5(EU/ml)=1式中：L为供试品的细菌内毒素限值，EU/ml；C

7、为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度，EU/ml。3.3.2.3制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品（140EU/支），用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml（方法同3.1.2.1）。3.3.2.4制备含内毒素的供试品溶液直接取供试品备用，再用此稀释液将3.3.2.3中的同支细菌内毒素标准品标题氯化钠注射液细菌内毒素分析方法验证方案/ZL页码4/6稀释成4个浓度即1.0EU/ml、0

8、.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的含内毒素的供试品溶液。3.3.2.6鲎试剂的准备取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转