实验一人类外周血染色体制备实验二人类染色体G显带技术

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1、医学遗传学实验讲义目录实验一实验二实验三实验四人类外周血染色体制备人类染色体G显带技术用小鼠微核测定法检测染色体畸变PCR法检测微卫星位点多态性南通大学神经科学系实验一人类外周血染色体制备染色体是基因的载体，人二倍体细胞的一个染色体上约有3〜4万个基因。染色体的数目或结构发生变化，必然导致其携带基因的增加或缺失,从而引起一系列临床症状。染色体检查已成为产前诊断及优生的重要手段。染色体技术有广泛的应用，本次实验主要介绍人类外周血染色体的制备。实验目的1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本实验原理外周

2、血中的淋巴细胞几乎都是处在Go期或5期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(phytohemagglutininPHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。实验用具及材料培养瓶、注射器、量筒、恒温水浴箱、离心机、移液器、离心管、滴管、试剂瓶、CO2培养箱、RPMI1640.小牛血清、植物血凝素(PHA)、NaHCO3.生理盐水、肝素、秋水仙素水溶液、氯化钾、甲醇、冰醋酸、4.0g/L酚红、链霉素、青霉素、实验步

3、骤一、细胞培养1・培养基的配制2.采血：酒精棉球消毒皮肤，肘静脉采血0.3〜0.5ml。在10ml培养基中滴入30・40滴全血，轻摇匀后置37°C恒温培养。3•培养：时间为68小时。培养过程中，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。4.秋水仙素处理：终止培养前2〜4小时，在培养基中加入秋水仙素2滴，使终浓度为0.07

4、ig/mlo以上步骤需无菌操作。二、染色体制备1•收集细胞：培养物转入离心管,lOOOrpm离心8分钟，弃上清。2•低渗处理：向刻度离心管中加入预温37°C的低渗液8ml,用滴管混匀，置37°C恒温水浴中低渗25分钟。2.预固定：低渗后

5、加入0.5ml固定液，轻轻混匀，静置5min,800rpm离心8分钟。3.一固定：弃上清，留约0.5〜lml，加入固定液8ml,轻轻混匀，静置8分钟，8OOrpm离心8分钟。4.二固定：弃上清，留约0.5〜lmb加入固定液6ml,轻轻混匀，静置8分钟，8OOrpm离心8分钟。5.三固定：弃上清，留约0.5-lml,加入固定液6ml，轻轻混匀，静置8分钟，8OOrpm离心8分钟。6.滴片：弃上清，留约0.5〜lmb混匀、滴片。滴片可使淋巴母细胞膜破裂，染色体分散开。滴片后需空气干燥。8染色：1:10Giemsa染色5分钟，细水洗去多余染液，气干，镜

6、检。注意事项1•培养温度：37±0.5°C,pH:7.2〜7.4。2.秋水仙素处理时间：2〜4小时，不能过长或过短。时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。2.低渗的浓度和时间：3.5%和25分钟。低渗使红细胞破裂，淋巴细胞膨胀、肿大。混匀细胞要轻，否则引起膜破裂，染色体丢失。4•去上清时必须要用吸管吸，否则目的物会丢失。4.离心前一定要配平，否则会损坏离心机。离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。5.固定液使用前临时配制。6.载玻片一定要洁净，否则染色体分散性不好。实验二人类染色体G显带技术染色体的染色技术可以分为普通染色

7、和显带染色两大类。实验目的初步掌握染色体G带标本的制备技术实验原理研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。实验用品1、材料：常规方法制备的中期人类染色体标本（标本片龄不超过30天为宜）o2、器材：显微镜、恒温培养箱、烤箱、恒温水浴箱、冰箱、染色缸、小蹑子、玻片架、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。3、试剂：0.25%胰蛋白酶溶

8、液、生理盐水、蒸馆水、Giemsa原液、Giemsa稀释液、1/15M磷酸缓冲液。实验步骤①标本老化：将常规制备的人染色体玻片标本（未染色的白片）气干后置70°C烤箱中处理2小时，然后转入37°C培养箱中备用，一般在第3~7天进行显带。%1将玻片标本浸入胰蛋白酶（已置4C冰箱中稳1小时以上冲40—50秒。%1立即取出玻片，用水洗去多余胰酶。%1染色。将标本浸入Giemsa染液（1:10的Giemsa原液和pH6.8的磷酸缓冲液）中染色5分钟左右。%1自来水冲洗（用细水小心冲洗）、晾干。%1镜检显带效果。在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换

9、油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。注意事项