人CD59RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定（医学论文）

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1、人CD59RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定作者：石学香高美华臧金林【摘要】目的利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPERretroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法用DNA重组技术，将3条60bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核昔酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro,脂质体法转染包装细胞系PhoenixA,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确；重组载体转染包装细胞，可表达绿色荧光蛋白，表明包装成功。结论特异性沉默CD59

2、基因的pSUPERretroRNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功，为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础，可望为肿瘤治疗开辟新途径。【关键词】RNA,双链；抗原,CD59;转染；逆转录病毒载体CD59是补体终末段的一种调节蛋白，具有抑制补体攻膜复合物的形成，保护细胞免遭补体介导的溶细胞作用。FONSATTI等［1］研究显示，CD59与肿瘤的生长失控及转移密切相关。由于在大多数实体瘤细胞膜表面存在或者高表达CD59等一系列的膜补体调节蛋白,使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单克隆抗体治疗中由补体介导的溶细胞作用,免疫逃逸是导致众多肿瘤治疗方案失

3、败的重要原因［2,3］。目前，在实体肿瘤的免疫治疗研究中，一个更加有效的策略是使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或不表达。本研究选择CD59作为靶基因，应用RNA干涉(RNAi)技术，构建携带针对CD59的pSUPERretroneo+gfp重组载体，以特异性沉默肿瘤细胞中CD59基因表达，观察小发夹RNA(shRNA)对靶基因表达的抑制作用，以及靶基因沉默对肿瘤细胞凋亡和增殖的影响。1材料与方法1・1材料逆转录病毒包装细胞PhoenixA及pSUPERretroneo+gfp质粒均由我院罗兵教授惠赠，大肠杆菌JM109为本实验室保存菌种,靶向CD59的60b

4、poligos由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自Fermentas公司；E.乙N.A.GelExtractionkit购自美国OMEGA公司。1・2方法1.2.1靶向CD59基因寡核昔酸的设计应用美国OligoEngine公司提供的双链RNA(siRNA)设计软件，将CD59的基因序列号输入后，通过Blast搜索确认与人的基因序列无同源性，选出3条序列(分别为218~236bp,261〜279bp,318〜336bp)作为实验组。按照pSUPER质粒说明书中构建发夹状短链RNA的原则，设计序列分别为：T1组，5'G

5、ATCCCCGCGTGTCTCATTACCAAAGTTCAAGAGACTTTGGTAATGAGACACGCTTTTTA3',As:5'AGCTTAAAAAGCGTGTCTCATTACCAAAGTCTCTTGAACTTTGGTAATGAGACACGCGGG3’;T2组，5'GATCCCCGTGTTGGAAGTTTGAGCATTTCAAGAGAATGCTCAAACTTCCAACACTTTTTA3’,As:5'AGCTTAAAAAGTGTTGGAAGTTTGAGCATTCTCTTGAAATGCTCAAACTTCCAACACGGG3';T3组，5'GATCCCCTG

6、AGCTAACGTACTACTGCTTCAAGAGAGCAGTAGTACGTTAGCTCATTTTTA3Z,As:5‘AGCTTAAAAATGAGCTAACGTACTACTGCTCTCTTGAAGCAGTAGTACGTTAGCTCAGGG3’。同时设计一段错义的19nt作为对照：C组，5'GATCCCCAGACTTGACTCCTGTCGAATTCAAGAGATCTGAACTGAGGACAGCTTTTTTTA3’,As:5'AGCTTAAAAAAGACTTGACTCCTGTCGAATCTCTTGAATCTGAACTGAGGACAGCTTGGG3'。1.2.2重

7、组载体的构建本研究选用美国OligoEngine公司的pSUPERretroneo+gfp质粒作为载体，该载体有EglU和Hindin两个酶切位点，两位点之间为长983bp的填充序列，将该填充序列切下后，与上述合成的具有BglD和HindDI黏性末端的60nt的寡核昔酸双链连接，构成重组质粒。1.2.3重组载体的鉴定PCR初步验证重组载体的正确性，设计一对引物，扩增产物为包括插入序列及其两侧部分碱基的一段长度为395bp的核昔酸，引物序列如下：pSUPERa:5zCCTTTATCCAGCCCTCACTC3’,pSUPERs:5‘AGACTGCCTTGGGAA

8、AAGCG3’o分别以重组质粒pSUPERsiCD5