几种常用的蛋白鉴定方法

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1、几种常用的蛋白鉴定方法传统的蛋片鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋口的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1图象分析技术(Imageanalysis)“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。在一系列高质量的2-DE凝胶产生(低背景染色，

2、高度的重复性)的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。首先,采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD(chargecoupleddevice)照相机；激光密度仪(laserdensitometers)和Phospho或Fluoroimagers,对图象进彳亍数字化。并成为以象素(pixels)为基础的空间和网格。其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工,以进彳亍斑点检测。利用Laplacian,Gaussian,DOG(differenceofGaussians)opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、

3、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。以PC机为基础的软件Phoretix-2D止挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。由于在2-DE中岀现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋口质的配比对于图象分析系统是一个挑战。IPG技术的出现已使斑点配比变得容易

4、。因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。用来配比的著名软件系统包括Quest,Lips,Hermes,Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。配比通常由…个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MWo在凝胶图象分析系统依据已知蛋口质的pl值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。所估计的

5、精确度大大依赖丁所建网格的结构及标本的类型。已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋口的分子量。未被修饰的小蛋白的错误率大约30%,而翻译后蛋白的出入更大。故需联合其他的技术完成鉴定。2微量测序(microsequencing)蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱(PMF)可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。目前已实现蛋白质微量

6、测序的自动化。首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用?subpicomole水平的蛋白质的鉴定。但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40min1个氨基酸的速率产生；与质谱和比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费3〜4$。这都说明泛化的Edman降解蛋片质不适合分析成百上千的蛋口质。然而，如果在一个凝胶上仅有儿个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的

7、序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋口质鉴定。当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达10〜20个/d,序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。选择BLAST程序，可与数据库相配比。目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，乂提高了其在蛋口质组研究中的作用。3与质谱(massspectrometry)相关的技术质谱已成为连接蛋口质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。用来分析

8、蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1)样品入机的离