免疫共沉淀与Western Blot

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1、免疫共沉淀与WesternBlot实验步骤:1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS小心漂洗一次）。2．加入500μl预冷的1×lysisbuffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。3．将细胞裂解液转移到1.5mleppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDSsamplebuffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（totalcelllysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PA

2、GE电泳，Westernblot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：1）分A/Gbeads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μlAgroseA/Gbeads及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysisbuffer（补充的lysisbuffer的量能使每管能均匀分配到50μlbeads及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μ（l含5μlbeads及5μl抗体）分配到1.5mlEppendorf管中，再加入400μl1×lysisbuffer，

3、备用；2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时；3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl1×lysisbuffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysisbuffer与等体积2×SDSsamplebuffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10

4、μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭1小时以消除非特异背景。7．封闭完毕，用TBST洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育（75rpm）1小时，使一抗与特异蛋白结合。8．回收一抗，用TBST洗3次（75rpm），每次5－10分钟。9．加入二抗，于脱色摇床孵育1小时，使二抗与一抗结合。10．用TBST洗3次，每次5－10分钟。11．将ECLA液和ECLB液各1ml，混

5、匀，放入二抗孵育后的PVDF膜30秒，将PVDF膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X光胶片曝光。12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker便于分析。注：如只做WesternBlot，跳过步骤4即可。实验试剂：1．PBS：NaCl20mM,KCL2.68mM,Na2HPO410mM,KH2PO41.76mM(pH7.4)，室温保存。2．1×lysisbuffer：Tris-HCl20mmol/L(pH7.5),NaCl150mM,EDTA1mM,EGTA1mM,TritonX-1001%,Sodiumpyrophos

6、phate2.5mM,β-Glycerrophosphate1mM,NaVO41mM,Leupeptin1ug/ml,－20℃保存。（稀释成1×lysisbuffer后加入1mMPMSF）3．2×SDSsamplebuffer：Tris-Cl（pH6.8）125mM，SDS4%，甘油20%，DTT100mM，溴酚兰0.02%，室温保存。4．分离胶（下层胶）（10%SDS-PAGE）15ml：30%丙烯酰胺5ml，10×lowerbuffer(pH8.8)1.5ml，H2O8.5ml，10%AP15μl，TEMED15μl。5．10×lowerb

7、uffer(pH8.8)100ml：42.25gTrisbase，10ml10％SDS，室温保存。6．压缩胶（上层胶）（4%SDS-PAGE）5ml：30%丙烯酰胺0.65ml，4×stackingbuffer(pH6.8)1.25ml，H2O3.05ml，10%AP5μl，TEMED5μl。7．4×stackingbuffer(pH6.8)100ml：6.06Trisbase，4ml10％SDS，室温保存。8．电泳缓冲液：Trisbase0.125M，甘氨酸0.96mM，SDS0.5%，室温保存。9．电转缓冲液：Tris25mM，甘氨酸0.2

8、mM，甲醇10%，室温保存。10．10×TBS(pH7.6)：Trisbase2.42%，NaCl8%，室温保存。11．TBST：1×TBS，Twee