Module 5 相对定量： ΔΔCT法和相对标准曲线法

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1、Module5相对定量：∆∆CT法和相对标准曲线法定量PCR:相对基因表达量2示例实验未处理样本处理后样本目的基因:Plat1问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化?3示例实验未处理样本处理后样本目的基因:Plat1问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化?4实验流程对照样本timet=0t=12t=24t=48totalRNAtotalRNAtotalRNAtotalRNAcDNAcDNAcDNAcDNA5目的基因与目的基因的比较DRnDCt=24–23=1Ct=24CyclesCt=23未处理组目的基因2-∆Ct=1/2处理组目的

2、基因6如果加入内参基因会怎样呢???DRnDCt=24–14=10DCt=23–13=10Ct=14Ct=24CyclesCt=13Ct=23未处理组目的基因和内参基因2-∆∆Ct=1处理组目的基因和内参基因7两种相对定量的方法比较Ct相对标准曲线法(∆∆Ct)法样本间的倍数关系8两种方法的区别???比较Ct(∆∆Ct)法相对标准曲线法•已知各个基因的扩增效率•每个基因都要做一条标准曲线•不需要每次都做标准曲线•准确的扩增效率计算•简单,经济,通量较高•工作量大,成本高,通量较低9∆∆Ct法的必要条件两个基因(目的基因和内参基因)必须有相一致的扩增效率，并

3、尽可能接近100%!10∆∆Ct法如何判断扩增效率一致同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似。11检查指数增长期的曲线之间是否平行内参基因目的基因12∆∆Ct法如何确认扩增效率接近100%K=-1/log(1+Ex)每对引物一条标准曲线13标准曲线可以帮助判断扩增效率•例如,斜率-3.3说明扩增效率接近100%.•更小的负值(例如-3.5)说明扩增效率小于100%.公式:E=10(-1/斜率)-114更多数学的方法...15如何选择相对定量的方法？A-F=∆Ct1AFB对应点相减GCCtHD目的基因IE内参基

4、因J[Template]16如何选择相对定量的方法？A-F=∆Ct1AB-G=∆Ct对应点相减2C-H=∆Ct3FBD-I=∆Ct4E-J=∆CtC5GCtHD目的基因IE内参基因J[Template]17如何选择相对定量的方法？在在Excel在ExcelExcel中制作图表Excel中制作图表A-F=∆Ct1∆CtB-G=∆Ct2C-H=∆Ct3∆Ct1∆Ct2∆Ct3∆Ct4∆Ct5D-I=∆Ct4E-J=∆Ct512345稀释点18如何选择相对定量的方法？根据斜率选择一种定量方法比较Ct︱斜率︱≤0.1(∆∆Ct)法︱斜率︱≥0.1相对标准曲线法19

5、∆∆Ct反应板设置对未知样本的目的基因和内参基因进行定量(每个样本三个重复)无模板对照(NTCs)–污染监测20∆∆Ct法结果计算步骤1:内参基因均一化样本差异Ct目的基因–Ct内参基因=DDDCt步骤2:其他和对照样本比较DCt处理样本–DCt对照样本=DDCt步骤3:使用公式计算倍数变化=22--DDCt21公式含义???C2T2=循环间扩增产物量的倍数变化(i.e.PCR扩增产物量倍增)DDC=处理样本和对照样本之间校正过的循环数变化T所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化22∆∆Ct计算示例CtCtCtCtdCtddCt2(

6、(--ddCt)ddCt)targ.norm.Untreated26.116.79.401Treated123.816.07.823.816.07.8--1.61.633显示出两倍的表达差异.Treated222.817.75.122.817.75.1--4.324.3200重复样本平均Ct值23∆∆Ct计算示例CtCtCtCtdCtddCt2((--ddCt)ddCt)targ.norm.Untreated26.116.79.401Treated123.816.07.823.816.07.8--1.61.633Treated222.817.75.122.

7、817.75.1--4.324.3200为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理24∆∆Ct计算示例CtCtCtCt∆CtddCt22((--ddCtddCt))targtarg..normnorm..Untreated26.116.79.401Treated123.816.07.823.816.07.8--1.61.633Treated222.817.75.122.817.75.1--4.324.3200为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理∆Ct值=Ct–Ct目的基因内参基因.25为什么Ct值要相减而不是相除???•C

8、t值是指数值,而不是线性值.•因此,我们不能直接用Ct值相除.•用