5、 相对定量： δδct法和相对标准曲线法

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1、Module5相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法相对定量PCR:相对基因表达量2示例实验未处理样本处理后样本目的基因：Plat1问题:样本处理后，目的基因的表达量有什么变化?3目的基因与目的基因的比较DRnDCt=24–23=1Ct=24CyclesCt=23未处理组：目的基因处理组：目的基因4如果加入内参基因会怎样呢?DRnDCt=23–13=10DCt=24–14=10Ct=14Ct=24CyclesCt=13Ct=23未处理组：目的基因和内参基因处理组：目的基因和内参基因5两种相对定量的方法比较C

2、t相对标准曲线法(ΔΔCt)法样本间的倍数关系6两种方法的区别?比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法•已知各个基因的扩增效率•每个基因都要做一条标准曲线•不需要每次都做标准曲线•准确的扩增效率计算•简单,经济,通量较高•工作量大,成本高,通量较低7如何选择相对定量的方法？A-F=ΔCt1AFB对应点相减GCCtHD目的基因IE内参基因J[Template]8如何选择相对定量的方法？A-F=ΔCt对应点相减1AB-G=ΔCt2C-H=ΔCt3FBD-I=ΔCt4E-J=ΔCt5GCCtHD目的基因IE内参基

3、因J[Template]9

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5、6/7/2013如何选择相对定量的方法？在Excel中制作图表A-F=ΔCt1ΔCtB-G=ΔCt2C-H=ΔCt3ΔCt1ΔCt2ΔCt3ΔCt4ΔCt5D-I=ΔCt4E-J=ΔCt512345稀释点10如何选择相对定量的方法？根据斜率选择一种定量方法比较Ct︱斜率︱≤0.1(ΔΔCt)法︱斜率︱≥0.1相对标准曲线法11ΔΔCt法12

6、LifeTechnologiesProprietary&

7、Confidential

8、6/7/2013ΔΔCt法的必要条件两个基因(目的基因和内参基因)必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%!13ΔΔCt法如何确认扩增效率每对引物一条标准曲线14

9、LifeTechnologiesProprietary&Confidential

10、6/7/2013标准曲线可以帮助判断扩增效率•斜率-3.3说明扩增效率接近100%.公式:E=10(-1/斜率)-115ΔΔCt法如何判断扩增效率一致同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相

11、似。16检查指数增长期的曲线之间是否平行内参基因目的基因17•后续实验中采用ΔΔCt法.19ΔΔCt反应板设置对未知样本的目的基因和内参基因进行定量(每个样本三个重复)无模板对照(NTCs)–污染监测21ΔΔCt法结果计算步骤1:内参基因均一化样本差异Ct目的基因–Ct内参基因=DCt步骤2:其他样本和对照样本比较DCt处理样本–DCt对照样本=DDCt步骤3:使用公式计算-DDCt倍数变化=222为什么Ct值要相减而不是相除?•Ct值是指数值,而不是线性值.•因此,我们不能直接用Ct值相除.•用相减来比

12、较Ct值.(例如:225÷220=25)23公式含义?C2T2=循环间扩增产物量的倍数变化(i.e.PCR扩增产物量倍增)DDC=校正过的处理样本和校正过的对照样本之间的循T环数差异所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化24ΔΔCt计算示例CtCtdCtddCt2(-ddCt)targ.norm.Untreated26.116.79.401Treated123.816.07.8-1.63显示出两倍的表达差异.Treated222.817.75.1-4.320重复样本平均Ct值25Δ

13、ΔCt计算示例CtCtdCtddCt2(-ddCt)targ.norm.Untreated26.116.79.401Treated123.816.07.8-1.63Treated222.817.75.1-4.320为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理Ct目的基因–Ct内参基因=ΔCt26ΔΔCt计算示例CtCtΔCtddCt2(-ddCt)targ.norm.Untreated26.116.79.401Treated123.816.07.8-1.63Treated222.817.75.

14、1-4.320为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理Ct目的基因–Ct内参基因=ΔCt27选择一个对照样本CtCtΔCtΔΔCt2(-ddCt)targ.norm.Untreated26.116.79.401Treated123.816.07.8-1.63Treated222.817.75.1-4.32028选择一个对照样本CtCtΔCtΔΔCt2(-ddCt)targ.norm.Untreated26.11