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1、实验1糖化酶固定化技术1实验目的(1)熟悉腮的固定化技术和原理。(2)掌握糖化陆的固定化操作。2实验原理在一定pH条件下，带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物，同时，海藻酸钠与钙离子在一•定条件下结合形成不溶于水的微球，从而使混合于其屮的糖化酶通过包埋固定化。戊二醛含有两个醛基，可与蛋白质中的氨基、酚基、铳基发牛•反应，相互交联而使固定化腮硬化，由于带正电荷的明胶与海藻酸根阴离了形成聚合物已将绝人部分游离酶包埠起来，因此这种交联主要发牛在切胶与戊二醛之间，使固定化酶的使用时间延长、机械强度增大、稳定性提高。3仪器和试剂
2、3.1主要仪器磁力搅拌器,pH计,水浴锅,500mL烧杯，50mL注射器，12号注射器针头，冰箱。3.2药品及配制(1)所需药品：糖化陆，明胶，海藻酸钠，氯化钙，戊二醛，牛:理盐水。(2)活力单位为70U/mL的糖化酚酚液100ml：用所给糖化酚配制。(3)浓度为3%的明胶溶液150ml：称収明胶4.5g,放入装有150mL蒸懈水的烧杯中,静止10分钟，水浴加热使明胶溶解，注意水浴的温度不超过70°C。(4)3%的海藻酸钠溶液150ml：称取海藻酸钠4.5g,放入装有150mL蒸憎水的烧杯屮，不断搅拌同时加热煮沸彻底溶解。
3、(5)1%氯化钙溶液500mlo(6)5%的戊二醛溶液500mlo(7)5%稀盐酸：调节pH用。4实验操作将15mL糖化他液与40°C150mL3%的海藻酸钠溶液混合搅拌，加入40°C150mL3%的明胶溶液混合乳化约lOmin,调pH为4.2〜4.6,缓慢搅拌并降温至5〜10°C,用12号注射器的针头将上述冷却液从3cm的高度注进1%氯化钙溶液屮，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4°C，球在氯化钙溶液中被硬化30min,将球取出置人30°C5%的戊二醛溶液屮进一步硕化lh,用生理盐水洗涤后，过滤得固定化糖化酚，贮存在0
4、〜5°C冰箱中备用。5实验结果观察所得固定化糖化酶的色泽和形状，粗测其粒度大小，测量其体积和沥干水后的重屋,把所得各项指标填入下表：表1所得固定化糖化酶的外观、体积和质量形状及人小色泽总体积(ml)总重量(g)6思考题1.木实验的固定化方法是所述哪几种酶固定化方法的结合？2.为何固定时乳化液的pH要保持在4.2~4.6?实验二固定化糖化酶活力的测定1实验目的(1)学习固定化糖化酶活力的测定方法。(2)了解糖化型淀粉酶活力人小对工艺生产的指导意义。2实验原理糖化型淀粉酶是-•类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄
5、糖，包插淀粉3-1,4-麦芽糖背酶(0-淀粉酶)、淀粉a-1,4-Wj萄糖糖莒酶(糖化酶)和淀粉3-1,6-葡萄糖背酶(异淀粉酶)。本实验的研究对象是淀粉Q-1,4-葡萄糖背酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1,4-糖昔键纶成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。碘量法原理：淀粉经糖化腮水解生成葡萄糖，衙萄糖貝-有还原性，其醛基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。l2+2Na0H-NaI0+NaI+H20NaIO+CH2OH（CHOH）4CHO-CH2OH（CHOH）1C
6、OOH+Nal体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。I2+2Na2S203->Na2S406+2NaI3仪器和试剂3.1主要仪器吸管（25ml、10ml、5ml、2ml）、定碘瓶、碱式滴定管、恒温水浴锅、分析天平。3.2试剂（1）2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉2g（预先100°C烘干约2h至怛重），用少最蒸憎水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸憎水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml,此溶液需当天配制。（2）0.2mol/LpH4.6醋酸钠缓冲液称取醋酸钠（CH3C00Na・3H20）2.
7、72g,用蒸馅水溶解，定容至100ml。冰醋酸（CH3COOH）1.17ml定容至100ml0分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。（3）20%氢氧化钠溶液（4）0.lmol/L碘液称取碘化钾35g和碘13g溶解在100ml蒸憎水中，定容至1000ml贮存于棕色瓶中。（5）0.lmol/L氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠加蒸镭水溶解，定容至1000mlo（6）lmol/L硫酸溶液量取浓硫酸5.6ml,慢慢加入于80ml蒸懾水中，冷却后定容至100ml,摇匀。（7）0.lmol/L硫代硫酸钠溶
8、液配制：称収结品硫代硫酸钠（N/Sa・5HQ24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸憾水中（无C02）,定容至1000ml,即得0.1mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶屮密封保存，配制后应放置一星期标定使用。4实验方法步骤（1）固定化糖化酶的称最称取实验
