食品生物技术实验指导书2012

《食品生物技术实验指导书2012》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、食品生物技术实验指导何志平等编农业与食品科学学院20012.10实验一质粒DNA的提取及电泳检测一实验目的通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。二实验原理1.细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。2.质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3.碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以

2、复性。三实验材料：转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌)四、实验用具和药品1.实验用具:摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（1.5mL）2.实验试剂：1溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0）10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2溶液II0.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等体积混合3溶液III5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml4TE缓冲液10mmol/LTris·

3、HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）570%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）6RNA酶将RNA酶溶于10mmol/LTris·HCl（pH7.5）、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。7加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰电泳缓冲液：0.045mol/LTris-硼酸  0.001mol/LEDTA（0.5XTBEbuffer）贮存液：5X：54gTris碱  27.5g硼酸  20ml

4、0.5mol/LEDTA（pH8.0）五实验步骤（一）细菌繁殖挑取白色的单菌落若干，转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/mlAmp),37℃过夜振荡（200r/min）培养。（二）菌体收集将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，离心30sec5000r/min；弃上清提取质粒（三）质粒提取方法一：碱裂解法提取质粒DNA1．.将上述沉淀重悬于250μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡；2．加入250μL溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5~10次；3．加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒

5、离心管5~10次；9000r/min离心5min上清转移到另一新1.5mL离心管中；4．加等体积氯仿，振荡混合，静置，9000r/min离心5min，上清转移到另一新1.5mL离心管中；5．加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min离心5min；6．弃上清，用70％ethanol洗涤；7．加30μLTE溶解，-20℃保存。方法二：试剂盒提取方法1.离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL，重悬菌体；2.加溶液Ⅱ250μL，轻轻颠倒离

6、心管~10次，静止（1-2分钟），至溶液澄清；3.加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，快速颠,20-30次；4.12000r/min离心10min；5.将上清转移到DNA结合离心管中，12000r/min离心1min；6.加入去蛋白试剂500μL，12000r/min离心1min；7.加洗涤液750μL，12000r/min离心1min；8.加洗涤液700μL，12000r/min离心1min；9.DNA结合柱12000r/min离心2min，去除残余的洗涤液；10DNA结合柱放入另一个新的1.5mL离

7、心管中，室温1-2min，加入洗脱缓冲液50-100μL；1112000r/min离心1min；（四）检测提取DNA质量的电泳检测。l取2ul质粒DNA+2ul加样缓冲液+6ulddH2O；l配制1%的琼脂糖凝胶l电泳30min，EB染色，拍照。注意事项：氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、口罩。六实验作业1.思考本实验的关键步骤是什么？2.琼脂糖电泳鉴定质粒DNA时，能看到几条带，快慢顺序是什么？3.附上电泳图片。实验二、固定化α-淀粉酶及活

8、性测定一、实验目的和原理目的：学会包埋法制备固定化酶的操作技术内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用包埋法。二、实验器材1．恒温水浴锅2．恒温振摇仪三、实验试剂1.海藻酸钠2.CaCl23.碘原液：称取碘1.1g。碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50m