生物技术实验指导书

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1、实验一质粒的提取和纯化3实验二质粒DNA的电泳和纯度检测6实验三PCR产物的TA克隆9实验四感受态大肠杆菌细胞的制备12实验五重组DNA转化大肠杆菌12实验六PCR扩增基因特异片段15实验七DNA片段的回收及纯化19实验八PCR法快速鉴定重组载体22实验九限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒24实验十外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测28实验十一RNA的提取及其纯度检测3235实验十二逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段实验十三DNA探针制备38实验十四Southern印迹杂交41实验十五Northern印迹杂交44实验十六荧光原位杂交(FISH)技术47实验十

2、七外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测50实验十八生物芯片技术53实验十九RNAi技术56实验二十蛋白质组技术58实验一质粒的提取和纯化实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用轻基磷灰石在特定的条件下（8mol/L尿素，0.24mol/L磷酸缓冲液pH=6.8）只吸附双链DNA的轻基磷灰石法（在上

3、述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链）等。本实验选做的是碱法。1•裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法（简称碱法）等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于lOkb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。2.分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的

4、双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。3.纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰RnaseA分解除去。蛋白质可通过酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，

5、氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉,而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿/异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（（1:1））一氯仿（或氯仿/异戊醇24:1）,处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿/异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DN

6、A也有一定的损失。实验内容:试剂1.LB培养液（1L）细菌培养用蛋白豚10g细菌培养用酵母粉5gNaCllOg用lOmol/LNaOH调至pH7.0,高压蒸气灭菌,4°C贮存.1.溶液I,可成批配置，灭菌后4C贮存。葡萄糖50mmol/LTris-Cl(pH&O)EDTA25mmol/LlOmmol/L2.溶液11(新鲜配制)NaOH0.2mol/LSDS1%60ml11.5ml28.5ml3.溶液III5mol/LKAc冰醋酸水配制好的溶液【II含3mol/L钾盐，5mol/L醋酸(pH4.8)卡那霉素(Kana):50mg/ml,过滤除菌.4.重蒸酚市售苯酚蒸

7、馆纯化(收集179~181°C之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上,4°C保存。5.氯仿异戊醇(24:1)6.无水乙醇&RNaseA(10mg/ml)9.3mol/LNaAc(pH5.2)10.TElOmmol/LTris-CI(pH&0)Immol/LEDTA材料含有质粒(pNTE-EGFP,pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a.操作步骤1.挑取琼脂培养板上的含有pNTE・EGFP,pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5mlLB培养液(含Kana50Mg/ml),37°C振荡培养过夜。2.取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12000r/min离

8、心2min