第五章 PCR产物的回收

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1、实验五PCR产物的回收一、实验目的及背景在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开，这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法现在常用的技术有：电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法玻璃奶法快速纯化凝胶回收试剂盒低熔点琼脂糖凝胶法65oC琼脂糖凝胶熔点低熔点琼脂糖凝胶37oC液体电洗脱法基本原理将电泳分离后含目的ＤＮＡ片

2、段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。二、实验试剂及仪器DNA回收试剂盒琼脂糖电泳仪、电泳槽紫外检测仪手术刀三、实验步骤切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入干净的离心管中称重，如凝胶重为100mg，可视为100μl（100mg≈100μl），以此类推。加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴融胶6-10min，间断（2-3min）混合，确保胶块完全融化

3、，当胶完全融化后，观察溶液的颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠（pH5.2），调整颜色和GSB颜色相同（黄色）。（为增加DNA回收量，可加入1倍体积异丙醇于已融化的凝胶溶液中，如凝胶重为100mg，加入100μl异丙醇）。待融化的凝胶溶液降至室温（高温时吸附柱结合DNA能力弱），加入吸附柱中静置1分钟，10,000×g离心1分钟，弃流出液。4.加入650μl溶液WB，10,000×g离心1分钟，弃流出液。5.10,000×g离心1-2分钟，去除残留的WB。6.将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50

4、μlEB或去离子水（pH＞7.0）（EB或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好），室温静置1分钟。7.10,000×g离心1分钟，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。结果与分析１．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。２．记录电泳结果。