高效液相色谱法测定鱼肌肉中的孔雀石绿残留

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1、206—-208．2010地质学刊第34卷第2期doi：10．3969／j．issn．1674-3636．2010．02．206高效液相色谱法测定鱼肌肉中的孔雀石绿残留张宗祥，陈军(泰州市环境监测中心站，江苏泰州225300)摘要：采用高效液相色谱法测定鱼组织中孔雀石绿的残留量。样品经高速均质后，用乙腈提取，合并提取液，用二氯甲烷再次萃取，有机相浓缩后过酸性氧化铝和PRS复合小柱洗脱，用乙腈定容。以乙腈一乙酸盐缓冲溶液为流动相，高效液相色谱分离，用荧光检测器检测，外标法定量。其检出限为o，7599／kg，加标回收率为84．0％一90．1％，相对标准偏差RSD为

2、2．98％～6．21％。关键词：高效液相色谱；孔雀石绿；鱼体中图分类号：s914文献标识码：A文章编号：1674—3636(2010)02—0206—030引言孔雀石绿是三苯基甲烷类工业染料，是药用染料中抗菌效力较强的一类，广泛应用于水产品养殖业，常用于防治鱼的增殖性肾病、水霉病、烂鳃病以及寄生虫病等，也可在水产品贩运过程中用作消毒剂，以延长鱼类的存活时间。孔雀石绿被鱼体吸收后，可代谢为隐色孔雀石绿，并沉积在脂肪组织中，具有明显的残留现象，其残留时间达到100d以上。动物试验证明孔雀石绿及其代谢产物对人畜有潜在的致畸、致癌和致突变作用，且代谢产物隐色孔雀石绿的

3、危害更甚于其母体，故被我国及世界上很多国家禁止使用。目前，检测孔雀石绿残留大多采用高效液相色谱法，紫外检测方法需要二氧化铅柱后衍生，过程繁琐。本实验参考GB／T20361--2006方法并作部分改良，将孔雀石绿还原成隐色孔雀石绿，采用荧光检测器，可以有效避免杂质干扰，具有高灵敏度，适合水产品中孔雀石绿残留的检测。1试验1．1主要仪器和试剂材料Waters2695高效液相色谱仪，Waters2475荧光收稿日期：2010—0l一12；编辑：侯鹏飞作者简介：张宗祥(1976一)，男，工程师。硕士，主要从事环境监测工作检测器，超声波细胞破碎仪，高速离心机，旋转蒸发仪

4、。隐色孑L雀石绿标准品100mg／L，乙腈、二氯甲烷均为色谱纯，20％盐酸羟胺溶液、对甲苯磺酸、冰乙酸为分析纯，硼氢化钾(纯度大于95％)、二甘醇(化学纯)，酸性氧化铝固相萃取柱19／3mL，PRS固相萃取柱500mg／3mL。1．2样品预处理将鱼体去鳞洗净，割取背部肌肉5．009置于50mL离心管中，依次加入10mL乙腈、1．5mL盐酸羟胺溶液、2．5mL对甲苯磺酸溶液和5mL乙酸铵缓冲溶液，涡旋2min，超声波破碎10min。加人59酸性氧化铝，涡旋2min，10000r／min离心15min。残渣中加入10mL乙腈，涡旋2min后，10000r／min离

5、心15min。合并2次上层清液至分液漏斗中。于上层清液中分别加入2mL二甘醇、3mL硼氢化钾溶液和30mL二氯甲烷，振摇5min，静置分层10rain。取有机相于45℃旋转蒸发至近干，加入2．5mL乙腈溶解。将上述液体过酸性氧化铝柱(下接PRS小柱)，并以5mL乙腈分2次洗涤旋蒸烧瓶，一并过柱。弃去酸性氧化铝柱，将PRS小柱吹至近干，加3mL乙腈淋洗液，收集流出液并用乙腈定容至3mL，过0．45斗m，供液相色谱测定。第34卷张宗祥等：高效液相色谱法测定鱼肌肉中的孔雀石绿残留1．3色谱分析条件色谱柱：AtlantisdCl8(4．6mm×250mm，5斗m)。流

6、动相：乙腈一乙酸铵缓冲液(pH=4．5)，体积比为80：20。进样量：101xL。流速：1．0mL／min。柱温：35℃。激发波长：265nm。发射波长：360nm。2结果与讨论2．1二氯甲烷和乙腈的比例应适当增加二氯甲烷的萃取用量，否则萃取操作不容易进行。试验中，乙腈的用量为20mE，当乙腈：二氯甲烷(y：y)=1：1时，由于乙腈对水的溶解度较大，分层不明显，萃取效率低下。试验中，二氯甲烷的加入量为30mL，既缩短了分离时间，又提高了提取的效率。2．2洗脱液pHPRS为丙磺酸柱，在强碱性条件下才能将隐色孔雀石绿洗脱下来，乙腈洗脱液应用氨水调节在pH值=10左

7、右。碱性过低，洗脱不下来；碱性过高，易损伤色谱柱。2．3色谱图和标准曲线取孔雀石绿标准溶液系列，按色谱条件进行测定，以标准溶液的浓度对峰面积制作标准曲线，孔雀石绿的浓度在5“g／L—100斗g／L范围内呈线性，标准曲线为：A=28733．71C一5400；R2=0．9998(图1、图2)。瑟蓑磊151；0图1孔雀石绿标准品色谱图220180160140撼604020O图2样品色谱图2．4回收率和精密度在空白样品中分别以l斗∥kg、5斗g／kg和lOwg,／kg的水平进行加标回收试验，结果见表l。表1回收率及精密度试验(n=6)2．5检出限在5．09空白样品中添

8、加5．01xg／mL标样1．00mL，