临床转化应用中有关脂肪源性干细胞获取需要解决的问题

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1、临床转化应用中有关脂肪源性干细胞获取需要解决的问题目前,有关脂肪源性干细胞(Adipose—derivedstemcells,ADSC)的分离和提取主要以Zuk等提出的方法为蓝本(见表1),进行改进形成各自使用的实验步骤。由于实验室分离、提取多用于基础研究，当中获取细胞的过程多数未能顾及临床应用时所考虑的问题，女恥传播动物源性疾病的风险、生产的时间、治疗的成本等。然而，转化医学“FromBenchtoBedside"的目标就是将实验室研究的成果应用于临床创造新的疗法。在此Z前，必须透彻地分析每个处理细胞的步骤是否会对人体存有潜在的危害，用起來是否经济、是否简便易于操作

2、等，以便新的疗法能够服务于大众的医疗需求。本文综合动物及人体来源提取脂肪源性干细胞(Adipose-derivedstemcelIs,ADSC)的过程，从ADSC分离、提取、扩增三方面进行剖析，以期为临床转化应用提供参考。1脂肪源性基质血管组分(SiromaJvascularfraction,SVF)的分离步骤存在的问题从脂肪组织分离SVF,使用的酶种类及其浓度的关系还没冇完整的研究报道。可以用于消化脂肪组织的酶有胶原酶、分散酶、透明质酸酶等，以胶原酶最为广泛使用，使用的浓度有0・01%、0.075%、0.05%,尚未有统-o陶凯等为了了解不同胶原酶浓度、胶原酶消化时

3、间和血清浓度对于人脂肪来源干细胞体外培养的不同效果，采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化，最后结果是在消化lh时，2.Omg/ml组消化细胞总数最多，提示消化过程中有浓度依赖性。陈超等曾评价不同的细胞对不同酶的耐受性不同，因此，必须把握酶消化的酶浓度与消化时间，提高分离细胞的纯度与存活率。如：观察组织块已经分散而失去块的形状，形成细胞一酶混合液，可以认为已消化充分。如果消化时间过长，培养瓶中的组织块就会变成细胞碎片。酶消化法的另一缺点就是存在细胞毒性，一般的消化酶有可能包含内毒素、其他的蛋白酶、异种蛋白。针对此问题，目前研究了几种非酶

4、性的细胞分离法，如：荧光激活细胞分选法(Fluorescence一activatedcel1sorting,FACS)、使用涂有特异性抗体的免疫磁珠筛选法(Immunomagnetic-beadpurification)＞乙醛脱氢酶的选择表达法等。这些方法虽然避免了消化酶的细胞毒性问题，却带来了过高的研究成木，不便于临床大量使用。因此现冇的分离法，除了要考虑是否符合GMP/GCP指南的要求，还需要更多实用的应用实验使之在实践中逐步完善。2正确提取ADSC在转化医学的意义迄今为止，研究报告指出影响ADSC提取的因索大致可分为六个方面:脂肪老化程度，脂肪细胞的活性随着患者

5、的年龄下降，能提取ADSC的量相对减少；对吸脂部位，人体不同部位I屯I积的脂肪含量冇别，较容易囤积脂肪的地方，如：腹部、大腿均能有效提取所需的ADSC：脂肪提取组织的粉碎程度，不同的抽脂方法会影响脂肪组织的粉碎程度，脂肪组织越细，胶原酶才能更有效消化脂肪组织并提取更多ADSC；浓度离心速度，研究表示高速离心会降低ADSC活性，但最理想的离心速度到目前为止并没有确切的方案：SVF的净度，抽脂后大量血细胞及纤维组织粘附在脂肪表面，虽然没有临床证据证明这些组织会妨碍ADSC成长，但属贴壁性生长的ADSC在体外实验屮显示大量倍增需要纯净的环境；细胞存储方法，不同的降温速度及冷

6、冻试剂都对ADSC的活性有影响，耍减低对ADSC的损害并将之发展为医疗产业，必须积极研究有效获取ADSC的方法。以上因素当中跟转化医学关系最为密切的，就是SVF的净度。从脂肪组织分离SVF后，一般实验室会使用生理盐水(PBS)或红细胞裂解液冲洗SVF,将多余的红细胞去除免得其妨碍ADSC的贴壁生长，从而提高所提的ADSC的纯度。Horn等的研究示，使用含氯化钱的红细胞裂解液相比单核细胞密度分离更快捷提取间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)。报告指出，经离心法初步分离出来的MSC混合了不同类型的基质细胞，要找出方便、有效独立提取ADS的方法才

7、能减少增殖时间，迅速达到适合临床应用的细胞量。使用氯化鞍裂解液的唯一缺点就是氯化鞍具细胞毒性，所以通过其提取的ADSC有可能存在违背临床转化应用的主旨。虽然说明氯化镀对人体有何直接影响的临床报道并不多，但曾经有研究指出经过氯化钱裂解后提取的ADSC存活力不高，因此，许多针对临床研究的实验室都直接放弃裂解的部分。针对红细胞裂解液在临床使用的安全性的研究并不多，碍于氯化鞍的毒性始终对人体细胞有潜在的安全威胁，对ADSC的存活力可能潜在的不良影响，要兼顾ADSC的提取效率，必须另觅有效且安全性较高的红细胞裂解液。最近，于春艳等的研究提出氯化鞍対人体内的自噬