产志贺样毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定

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1、产志贺样毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴中华医学检验杂志1999年第5期第22卷论著作者：朱庆义李连青郭兆彪张敏丽杨瑞馥赵瑞珍周向红单位：朱庆义李连青赵瑞珍周向红030013山西省儿童医院分子微生物室；郭兆彪张敏丽杨瑞馥军事医学科学院微生物流行病研究所关键词：大肠杆菌感染；腹泻；聚合酶链反应我们用3'端特异性引物聚合酶链反应(3‘BS-PCR)分析原理，将慢性乙型肝炎(乙肝)患者血清及白细胞内的乙肝病毒(HBV)前C区1896位点突变的突变型及野生型分离，探讨HBV有意义突变屮，最常见的1896位点突变在外周血白细胞内的存在状态，结合临床进一步阐明乙肝的发病机理。一、材料和方法1•

2、标本來源：经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测及HBVDNA检测均阳性的乙肝患者101例，均为我院1996年2月〜1998年2月门诊及住院病例。其中男67例，女34例；年龄7〜72岁，平均34.4岁。2.血清及白细胞内DNA提取:血清DNA提取按常规方法进行。白细胞内DNA提取：取200u1依地酸(EDTA)抗凝血于0.5ml离心管中离心，弃上清，加白细胞分离液50卩1和双蒸水200n1混匀，离心并弃上清后，用上法再重复1次。沉淀加入裂解液,置100°C水浴10分钟。3.PCR引物及反应条件：采用文献［1-3］报道的3,BS-PCR引物核昔酸序列设计原理，设计合成3条引物，第1

3、,2两条引物的碱基位置在1879〜1896这一区段，第3条引物的碱基位置在2270〜2287这一区段，1,2两条引物3,端最后一个碱基分别对应于野生株和突变株，第3条引物分别与1,2两条引物构成PCR引物对。以下两对引物(分别用I和II表示)扩增产物长度为520bpo在40P1反应体系中含适量引物、dNTPs、0.01%苯磺酸、Taq-DNA聚合酶和8n1标本。PCR经预变性共32个循环。二、结果和讨论1.3,BS-PCR检测白细胞内HBVDNA点突变结果。引物II扩增HBVDNA阳性者即突变株12例，两种引物扩增均阳性者23例,均阴性者44例。突变总检出率34.5%,其中单纯

4、突变株检出率11.8%,野生株与突变株同时检出率22.7%02.白细胞内HBV标志与血清中HBV标志的关系。日前人们对外周血单个核细胞(PBMCs)中的HBVDNA与血清中HBVDNA的关系存在着不同意见。有认为两者关系不明确，有的则认为两者有一致性的倾向。从木组白细胞内野生株与突变株同时检出的23例中，有2例在血清中未检出，单纯突变株的12例及单纯野生株的22例血清中，也各有1例未检出，可见两者之间的关系并不很明确，还有待进一步研究。但可提示血清中HBVDNA阴性的患者白细胞内不仅有野生株和突变株感染，而且突变株和野生株可同时存在。2.慢性乙肝患者PBMCs内不仅普遍存在HB

5、VDNA,而且还存在HBV突变株。从本组白细胞内野生株的总检出率44.6%(45/101)与Moraleda等PBMCsHBVDNA检出率44.4%(115/259)—致，以及本组白细胞内突变株总检出率34.6%(35/101)分析，认为:(1)用3ZBS-PCR在慢性乙肝患者的白细胞中分离出野生株及突变株，是一种较能准确反映乙肝患者HBVDNA及HBV突变株存在状态的方法。(2)慢性乙肝患者口细胞内不仅普遍存在HBVDNA,同时还存在HBV突变株。2.检测慢性肝炎白细胞内HBVDNA前C区突变，可能能间接地反映肝细胞内HBVDNA突变株的存在状态。有研究发现，肝细胞内HBVD

6、NA和PBMCs内HBVDNA的存在之间有直接关系，不管患者是否经过抗病毒治疗，当肝HBVDNA逐渐消失时，带有HBVDNA的PBMCs的数量也相应减少。参考文献1朱滨，王国荃•基因诊断技术进展•中华医学检验杂志,1996,19：298-299.2GoergenB.ComparisonofmutationspecificPCRanddirectsequencingofPCR-productsforthedetectionoftheHBVpre~Cstopcodon.Hepatology,1990,16:232-233.3王小飞，刘华瑞，王锦荣，等.乙型肝炎和肝癌患者乙型肝炎病毒

7、前C区1896位点突变的研究•中华传染病杂志，1996,14：11-12.（收稿：1998-07-14修回：1998-10-08）